前列腺移行帶和外周帶生物學(xué)差異的研究——不同帶性基質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、梯度雄激素和轉(zhuǎn)化生長因子應(yīng)答及其基因表達(dá)差異的研究.pdf

1、本文分為三部分研究了前列腺移行帶和外周帶生物學(xué)差異。 第一部分：前列腺移行帶和外周帶不同帶性細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)差異的研究 目的：前列腺TZ和PZ基質(zhì)中最活躍成分基質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)的差異。 方法： ①正常前列腺標(biāo)本收集(尸供體)，McNeal解剖定位分離前列腺TZ和PZ組織，應(yīng)用HE染色和透射電鏡鑒定并觀察TZ和PZ組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，剪切、Ⅰ型膠原酶消化后，梯度離心法原代培養(yǎng)PZ和TZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞

2、和上皮細(xì)胞。 ②倒置顯微鏡、透射電鏡和免疫組化分別進(jìn)行前列腺TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的鑒定和觀察。 結(jié)果： ①前列腺TZ間質(zhì)組織致密整齊，而PZ組織較為疏松。TZ組織中腺上皮為假覆層，未見固縮現(xiàn)象，線粒體有腫脹出現(xiàn)?；|(zhì)平滑肌細(xì)胞分泌型較多，核幼稚，長圓型，核膜鋸齒少，肌絲量少。細(xì)胞器較多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和核糖體可見。成纖維細(xì)細(xì)胞長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多。細(xì)胞外膠原成分多；PZ組織中腺上皮為假覆層，腺腔

3、內(nèi)較多分泌顆粒，部分存在固縮的腺上皮，可見空泡變性，線粒體量多。基質(zhì)平滑肌細(xì)胞成熟型較多，核鈍園，核膜鋸齒樣，肌絲排列整齊，有密斑，細(xì)胞器少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體可見。成纖維細(xì)胞細(xì)長形，核呈梭形且窄，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少許。 ②TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞分別原代培養(yǎng)成功。 ③原代培養(yǎng)TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞成長梭形。透射電鏡鑒定TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，觀察TZ基質(zhì)成纖維細(xì)胞，胞漿內(nèi)富含較多高爾基復(fù)合體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量線

4、粒體：PZ基質(zhì)細(xì)胞比TZ細(xì)胞狹長，胞漿內(nèi)可見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，還有少量線粒體和高爾基復(fù)合體。不同帶基質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)存在差異，提示TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞間存在合成代謝差異。 結(jié)論：前列腺TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞存在超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)上差異，提示基質(zhì)細(xì)胞生長過程中分泌、合成代謝等功能具有差別；前列腺基質(zhì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)的肌性化改變與年齡相關(guān)；不同帶性基質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等形態(tài)的差異，是前列腺TZ和PZ不同帶性生物學(xué)差異的表現(xiàn)之一，可能是前列腺疾病發(fā)生

5、帶性差異的原因。 第二部分：前列腺移行帶和外周帶不同帶性基質(zhì)細(xì)胞對(duì)梯度雄激素和梯度轉(zhuǎn)化生長因子應(yīng)答的研究。 目的：研究前列腺TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞分別對(duì)梯度雄激素和梯度轉(zhuǎn)化生長因子β<,1>應(yīng)答的反應(yīng)。 方法： ①不同比例的前列腺PZ和TZ基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)2d、4d、6d、8d后MTT法檢測(cè)觀察不同帶性基質(zhì)細(xì)胞生長特性。 ②不同濃度雙氫睪酮(DHT)或轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β<,1>)各自刺

6、激TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同基質(zhì)細(xì)胞生長特性，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)測(cè)定不同基質(zhì)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化，Western blot檢測(cè)不同基質(zhì)細(xì)胞增殖(PCNA)和凋亡(Bcl-2)基因表達(dá)的變化。 結(jié)果： ①對(duì)2d、4d、6d和8d不同基質(zhì)細(xì)胞生長曲線MTT檢測(cè)比較，PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞生長速度明顯快于TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞，TZ<,45>基質(zhì)細(xì)胞生長速度明顯快于TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞，與前列腺不同快

7、速增長期相吻合。 ②不同DHT濃度梯度(25～1000μM)變化，隨著濃度的降低TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞呈較明顯生長增強(qiáng)趨勢(shì)，而PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞隨DHT濃度降低呈逐漸緩慢生長增高趨勢(shì)。不同帶基質(zhì)細(xì)胞生長對(duì)DHT的反應(yīng)性存在差異。 ③不同TGF-β<,1>濃度梯度(10～80pM)變化，隨著濃度的降低TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞呈緩慢生長，20pM后生長增強(qiáng)趨勢(shì)明顯，而PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞隨TGF-β<,1>濃度降低呈明顯

8、生長增高趨勢(shì)，20pM后生長呈減弱趨勢(shì)。不同帶基質(zhì)細(xì)胞生長對(duì)TGF-β<,1>的反應(yīng)性存在差異。 ④利用FCM檢測(cè)，隨著加入DHT濃度遞增(10nM～1000nM)，TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞凋亡率增高，PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞凋亡率則降低，兩組比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著DHT濃度的變化TZ<,20>和PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞存在凋亡率的差異。不同濃度組間凋亡率雖有增高和降低趨勢(shì)，但組間比較(P>0.05)，差異沒有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義。不同濃度DHT的變化，TZ<,20>和PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期各組間比較(P>0.05)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TZ<,20>和PZ<,20>兩組間比較(P>0.05)，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示DHT不影響TZ<,20>和PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期。 結(jié)論：前列腺TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞對(duì)梯度雄激素DHT和梯度TGF-β<,1>均存在不同的應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)不同的生長特性、細(xì)胞凋亡率和凋亡抑制基因Bcl-

10、2的差異表達(dá)，這種對(duì)雄激素DHT和TGF-β<,1>的不同應(yīng)答反應(yīng)，顯現(xiàn)細(xì)胞凋亡率和凋亡基因表達(dá)的差異，可能是前列腺疾病發(fā)生不同帶性差異的分子基礎(chǔ)；前列腺TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞的生長、細(xì)胞凋亡和凋亡基因表達(dá)等變化具有DHT和TGF-β<,1>相關(guān)性。 第三部分：前列腺移行帶和外周帶不同帶性基質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)差異及其對(duì)前列腺癌上皮細(xì)胞成瘤影響的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：高通量研究前列腺TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞差異基因表達(dá)，以及TZ和P

11、Z不同帶性基質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌上皮細(xì)胞成瘤的影響。 方法 ①利用SBC-Human cDNA基因芯片技術(shù)篩選前列腺TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)的差異，并進(jìn)行相關(guān)功能分類及差異基因顯著性分析。 ②利用3μmPET膜細(xì)胞插片，TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞一前列腺癌上皮細(xì)胞雙層共培養(yǎng)細(xì)胞模型建立，倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察，DHT或TGF-β<,1>刺激后，Western blot檢測(cè)不同組前列腺癌上皮細(xì)胞增殖(PCNA)和凋

12、亡(Bcl-2)基因表達(dá)的變化。 結(jié)果： ①通過基因芯片分析比較TZ<,20>和PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞，差異基因篩選上調(diào)基因1387個(gè)，下調(diào)基因1319個(gè)，進(jìn)一步GO-Analysis分析對(duì)差異基因予以最顯著、最集中的基因功能歸類，上調(diào)功能歸類38類，下調(diào)有28類；Dif-Path分析TZ<,20>和PZ<,20>差異基因Pathway最具有顯著性功能上調(diào)15個(gè)，下調(diào)2個(gè)(P<0.05)。結(jié)合Pathway和GO分類共同

13、顯著性水平的上調(diào)基因和下調(diào)基因，得到實(shí)驗(yàn)性狀差別最重要的基因。 ②不同帶性基質(zhì)細(xì)胞．前列腺癌上皮共培養(yǎng)細(xì)胞模型成功構(gòu)建，共培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)佳。前列腺癌上皮細(xì)胞PC-3與TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，包括TZ<,20>、PZ<,20>和TZ<,45>基質(zhì)細(xì)胞，予一定濃度DHT、TGF-β<,1>刺激后，Western Blot測(cè)定PC-3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，TGF-β<,1>組>DHT組>未加干預(yù)組，TZ<,45>組>PZ<,20>組

14、>TZ<,20>組。任何共培養(yǎng)模型組PC-3細(xì)胞Bcl-2表達(dá)均弱于單培養(yǎng)PC-3。各共培養(yǎng)組PC-3細(xì)胞PCNA表達(dá)無明顯差別。 ③不同帶性基質(zhì)細(xì)胞．前列腺癌上皮共培養(yǎng)荷瘤鼠模型成功建立，30d后觀察PC-3組、PC-3/PZ<,20>、PC-3/PZ<,20>/TGF-β<,1>、PC-3/TZ<,20>、PC-3/TZ<,20>/TGF-β<,1>荷瘤鼠，存在大小不等腫瘤結(jié)節(jié)，形狀不規(guī)則，表面不光滑，質(zhì)韌硬不均，較固定。裸

15、鼠瘦弱，精神狀態(tài)、飲食差。PC-3/PZ<,20>和PC-3/PZ<,20>-TGF-β<,1>兩組瘤重比較p<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞在TGF-β<,1>作用后對(duì)PC-3細(xì)胞成瘤具有一定影響，PZ<,20>和TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞對(duì)TGF-β<,1>作用的反應(yīng)性不同。PC-3、PC-3/PZ<,20>-TGF-β<,1>、PC-3/TZ<,20>-TGF-β<,1>組瘤重兩兩比較p均<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)

16、學(xué)意義，PZ<,20>和TZ<,20>細(xì)胞在TGF-β<,1>作用后對(duì)PC-3細(xì)胞成瘤存在差異，說明PZ<,20>和TZ<,20>基質(zhì)細(xì)胞間存在生物學(xué)特性和功能的差異，且TGF-β<,1>作用共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)PC-3細(xì)胞的成瘤具有重要影響。PC-3、PC-3/PZ<,20>、PC-3/TZ<,20>組瘤重兩兩比較p均>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：前列腺TZ和PZ不同帶性基質(zhì)細(xì)胞間存在不同功能基因的差異表達(dá)，并具有不同功能分

17、類，不同組別基質(zhì)細(xì)胞．前列腺癌上皮細(xì)胞共培養(yǎng)PC-3細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)的差異，以及不同帶性基質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌上皮細(xì)胞成瘤具有差異，更加證明前列腺TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞間存在差異基因的表達(dá)，導(dǎo)致TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞具有不同的功能特性；TGF-β<,1>作用TZ和PZ基質(zhì)細(xì)胞后引起各帶細(xì)胞不同的效應(yīng)，出現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能的變化，特別是肌性轉(zhuǎn)化，是前列腺癌“活性基質(zhì)”的細(xì)胞表現(xiàn)，TGF-β<,1>在前列腺癌發(fā)生過程中具有重要作用。同時(shí)