鄰苯二甲酸酯高低累積品種菜心的生理學(xué)差異及其分子機(jī)制研究.pdf

1、農(nóng)田土壤中鄰苯二甲酸酯（PAEs）的污染狀況日趨嚴(yán)重，直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，嚴(yán)重危害人體健康。篩選對污染物低累積作物品種（污染安全品種）是在土壤普遍污染情況下確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要策略。本文以我國南方地區(qū)重要蔬菜菜心（Brassica parachinensis L.）為研究對象，針對兩種典型的PAEs化合物鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯（DEHP），篩選獲得對DBP和DEHP高低累積的兩個(gè)菜心品種，通過比

2、較高、低累積菜心品種植株間的PAEs富集和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)、亞細(xì)胞分布、抗氧化能力、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、光合作用等生理學(xué)特征及轉(zhuǎn)錄組和蛋白組水平下的分子生物學(xué)差異，揭示不同基因型菜心高、低累積PAEs性狀形成的生物學(xué)機(jī)制。本論文的主要研究結(jié)果如下：（1）PAEs高、低累積菜心品種的篩選
　　通過盆栽試驗(yàn)研究了28種菜心在對照、低PAEs（添加DBP和DEHP各為10 mg/kg）和高PAEs（添加DBP和DEHP各為100 mg/kg）污染土壤

3、中的PAEs累積特征。在低污染下所有品種菜心地上部 PAEs含量（干重）范圍：DBP為0.101~0.373 mg/kg（最大差異為3.7倍）、DEHP為0.125~0.721 mg/kg（最大差異為5.2倍）；在高污染下DBP為0.355~2.027 mg/kg（最大差異為5.3倍）、DEHP為0.783~8.527 mg/kg（最大差異為6.8倍）?？梢?，不同菜心品種地上部 PAEs含量存在顯著差異。同時(shí)，各品種菜心對 DBP和DE

4、HP的累積量均呈顯著正相關(guān)（p<0.01），表明菜心可同時(shí)吸收這兩種化合物，且不存在競爭性累積。因此，本文篩選獲得了Lvbao70為PAEs低累積品種（簡稱LB），Huaguan為PAEs高累積品種（簡稱 HG）。通過比較這兩種菜心富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)高、低累積菜心品種地上部的富集系數(shù)差異不顯著，但是低累積菜心的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（從根到地上部）顯著低于高累積菜心品種，致使更多的PAE滯留在根部，導(dǎo)致地上部PAEs累積較少，成為地上部低累積性

5、狀形成的關(guān)鍵因素。
　?。?）高、低累積菜心品種PAEs亞細(xì)胞分布及抗氧化能力差異
　　采用差速離心法對高、低累積菜心品種中PAEs的亞細(xì)胞分布情況進(jìn)行比較分析表明，兩種菜心PAEs均主要分布于細(xì)胞壁，但低累積菜心品種根部細(xì)胞壁的PAEs含量明顯高于地上部細(xì)胞壁中含量，而對于高累積菜心品種這種差異不明顯，這可能是低累積菜心品種具有更低轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的內(nèi)在機(jī)制，即低累積菜心根部細(xì)胞壁能夠滯留更多的PAEs，從而減少PAEs向地上部轉(zhuǎn)

6、運(yùn)。因此，PAEs亞細(xì)胞分布差異可能是導(dǎo)致兩種菜心地上部PAEs累積差異形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。另外，通過測定兩種菜心不同組織的抗氧化酶活性（包括 POD、PPO、SOD、CAT和GST）及丙二醛含量，比較不同PAEs污染水平下其抗氧化能力，結(jié)果顯示高累積菜心品種的地上部及根組織的抗氧化脅迫能力更強(qiáng)，說明抗氧化系統(tǒng)在菜心響應(yīng)PAEs累積和脅迫中發(fā)揮重要作用。
　?。?）高、低累積菜心品種葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與光合作用差異
　　采用土

7、壤盆栽試驗(yàn)，研究了兩種菜心在不同DBP污染水平下的生物量、葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和光合作用等生理特征，結(jié)果表明兩種菜心在這些生理生化特征差異明顯。與對照相比，在低污染水平下兩種菜心葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化不大，但是在高污染水平下，兩種菜心葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化明顯。特別是低累積菜心葉肉細(xì)胞毒害特征更明顯，如大部分葉綠體不完整或解體，淀粉粒大量減少，嗜鋨顆粒大量累積等，而高累積菜心盡管許多葉綠體腫脹明顯，但仍能保持其完整性，且細(xì)胞質(zhì)區(qū)隔化程度更高。這

8、說明菜心高累積品種比低累積品種葉肉細(xì)胞對高濃度DBP累積具有更高的耐受性。在光合作用方面，在低污染水平下兩種菜心的光合受損程度不大，低累積菜心反而在某些指標(biāo)中出現(xiàn)激效反應(yīng)（Hormetic response）；而在高污染水平下，相比于高累積菜心品種，低累積菜心的葉綠素含量、碳同化能力、氣體交換參數(shù)、光合作用效率、光合電子轉(zhuǎn)移能力等下降更為明顯，光合系統(tǒng)受損程度更為嚴(yán)重。因此，相比于高累積菜心品種，低累積菜心由于葉肉細(xì)胞對DBP毒害耐受能

9、力更低，通過改變自身相關(guān)的組織結(jié)構(gòu)和生理機(jī)制，以減少莖葉對有害物質(zhì)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和累積以免遭毒害，屬于“避性”抗污染脅迫機(jī)制，而高累積菜心莖葉具有較高抗脅迫能力，植株體內(nèi)能夠耐受較高濃度的PAEs累積，屬于“耐性”抗污染脅迫機(jī)制。
　　（4）菜心累積DBP高低差異的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
　　運(yùn)用 RNA-seq技術(shù)對高、低累積菜心品種在 DBP污染脅迫下的葉片轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，采用無參轉(zhuǎn)錄組拼接獲得Unigene序列作為參考基因組

10、，進(jìn)行基因定量和差異表達(dá)分析。四組菜心樣品測序共獲得28.67Gb數(shù)據(jù)，140,566條Unigene。對這些Unigene進(jìn)行生物信息學(xué)注釋，共獲得110,642條Unigene的注釋信息（占總數(shù)的78.71％）。進(jìn)行基于合并組裝Unigene庫的基因結(jié)構(gòu)分析，共鑒定SSR標(biāo)記32,208個(gè)。通過比較兩種菜心在DBP脅迫前后篩選獲得的差異表達(dá)基因，分別進(jìn)行GO功能注釋和Pathway富集分析，獲得了與抗DBP脅迫相關(guān)的功能注釋信息，如

11、防御機(jī)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、光合作用過程、氧化還原過程、抗病途徑和抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等。Pathway聚集分析顯示，差異表達(dá)基因參與了細(xì)胞壁防御途徑、抗氧化途徑、核糖體途徑、植物激素信號傳導(dǎo)途徑、苯丙烷代謝途徑和丙氨酸代謝途徑等抗脅迫相關(guān)代謝途徑。其中，高累積菜心品種的抗DBP脅迫代謝途徑遠(yuǎn)多于低累積菜心，說明其對DBP脅迫在轉(zhuǎn)錄組水平表現(xiàn)出更高的應(yīng)激能力，這與前面所述高累積菜心具有更高耐受性的研究結(jié)果一致。另外，高累積菜心品種對DBP脅迫表

12、達(dá)更多的響應(yīng)基因，其中上調(diào)基因數(shù)明顯多于低累積菜心，說明這兩種菜心在響應(yīng)DBP脅迫過程中基因表達(dá)模式存在顯著差異。通過比較兩種菜心響應(yīng)DBP脅迫的基因表達(dá)差異，在低累積菜心中篩選獲得可能與DBP脅迫相關(guān)的上調(diào)基因15個(gè)，下調(diào)基因35個(gè)；在高累積菜心中篩選獲得可能與DBP脅迫相關(guān)的上調(diào)基因28個(gè)，下調(diào)基因14個(gè)。其中，對于在兩種不同基因型菜心中均有表達(dá)，但上/下調(diào)水平相反的基因，可能是決定不同基因型菜心高/低累積DBP性狀形成密切相關(guān)的關(guān)

13、鍵基因，可以作為在分子水平研究不同基因型菜心高/低累積DBP形成機(jī)制的首要候選基因，包括幾丁質(zhì)酶、非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白、金屬硫蛋白、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶蛋白、DREB轉(zhuǎn)錄因子和過氧化物酶體(S)-2-羥基酸氧化酶基因等。
　?。?）菜心累積DBP高低差異的蛋白組學(xué)分析
　　在轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，采用 iTRAQ技術(shù)對高、低累積品種菜心在 DBP污染脅迫下的葉片差異蛋白組進(jìn)行研究，并對差異蛋白進(jìn)行 GO功能注釋和Path

14、way富集分析，最后將差異蛋白與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中的差異基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以篩選獲得決定菜心高/低累積DBP性狀形成的關(guān)鍵蛋白。共鑒定蛋白總序列為5,692個(gè)，其中高累積菜心中篩選獲得與DBP脅迫響應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白上調(diào)76個(gè)、下調(diào)40個(gè)，低累積菜心中上調(diào)32個(gè)、下調(diào)47個(gè)。GO分析結(jié)果表明，低累積菜心品種LB的差異蛋白主要富集在基礎(chǔ)生物學(xué)過程和逆境脅迫響應(yīng)過程方面，而高累積菜心品種HG中差異蛋白主要富集抗脅迫反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及損傷修復(fù)

15、等方面。Pathway富集分析表明，低累積菜心中差異蛋白顯著富集于碳代謝、光合作用、核糖體、丙酮酸代謝和TCA循環(huán)等，高累積菜心中差異蛋白顯著富集于吞噬體、苯丙氨酸代謝、苯丙烷生物合成、苯環(huán)化合物降解和過氧化物酶等。由此可見，DBP脅迫對低累積菜心的基礎(chǔ)生物學(xué)過程影響較大，而高累積菜心體內(nèi)富集更多的代謝途徑直接或間接參與植株的抗脅迫反應(yīng)，這也從蛋白水平說明了高累積菜心品種比低累積菜心具有更高的DBP毒害耐受性。關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，兩種菜

16、心的轉(zhuǎn)錄組與蛋白組信息關(guān)聯(lián)性不高，相關(guān)性僅為0.3左右。進(jìn)一步篩選與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的差異蛋白，共篩選獲得33個(gè)，其中低累積菜心品種為14個(gè)（上調(diào)6個(gè)，下調(diào)8個(gè)），高累積菜心品種為19（上調(diào)16個(gè)，下調(diào)3個(gè)）?？梢姡呃鄯e菜心品種中上調(diào)的關(guān)聯(lián)蛋白更多，且多數(shù)與植物抗逆性密切相關(guān)，如 SOD、過氧化物酶、熱激蛋白、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質(zhì)酶、細(xì)胞色素 P450、谷胱甘肽過氧化物酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等，說明高累積菜心品種具有更多的抗DBP脅迫蛋白