細胞固相色譜法研究牡丹皮中的效應成分.pdf

1、細胞膜固相色譜法是用細胞膜作為固定相篩選藥物活性成分的方法，該方法可以直接有效地反映出藥物中活性成分與細胞膜上靶點的相互結合，最快捷有效的將藥物活性成分篩選與分離有機地結合在一起。細胞膜上有諸多的受體和其他藥物作用的靶位點，中藥能通過與細胞膜上的靶點結合而對其產(chǎn)生保護作用。由于中藥成分復雜，其保護作用的效應成分不明確，如果中藥提取物具有保護細胞及防止損傷的作用，其中的效應成分是通過與細胞膜上的受體和其他的靶位點結合而發(fā)揮作用的。在此基礎

2、上建立細胞膜固相色譜法，即模仿藥物與細胞結合的條件，使效應成分與效應靶點結合，再洗脫未結合的成分，再將與細胞結合的效應成分從其結合的受體或靶位點上解離下來，這些效應成分可用色譜-質譜方法（如高效液相色譜-質譜）進行研究分析，再驗證其中的準效應成分的藥理學活性。細胞膜固相色譜法是一種研究中藥效應物質基礎的新方法，該方法克服了以往成分分離與活性成分篩選脫節(jié)的弊端，它使活性成分的分離與篩選結合在一起，進而探討藥物的作用機理，是化學成分—效應—

3、作用機理聯(lián)動的一種藥物研究方法，尤其適合于天然藥物活性成分的研究。丹皮是一味常用中藥，性微寒，味苦辛，無毒，入心、肝、腎經(jīng)，具有清血，活血散瘀的功能。丹皮常被用于治療腎病的中藥復方中，但是其保護和治療腎臟疾病的活性成分和作用機理并不清楚。系膜細胞與近曲小管上皮細胞是腎臟中重要的組成細胞，參與了各種腎臟病的病理過程，在腎病中具有重要的地位，因此本研究分別以腎小球系膜細胞和近曲小管上皮細胞的活性細胞膜作為固定相，采用細胞膜固相色譜法篩選丹皮

4、中保護腎臟的活性成分。
　　本研究分為四個部分：第一部分對中藥牡丹皮水提液進行研究，建立牡丹皮水提液的UPLC指紋圖譜，采用C18色譜柱，乙腈-0.1％的甲酸水為流動相梯度洗脫，流速為0.49ml/min，摸索最適檢測波長，確定檢測波長為254nm，柱溫為室溫。對不同批次的牡丹皮水提液進行指紋圖譜分析，通過UPLC-MS技術指認指紋圖譜中主要峰的歸屬，得到的牡丹皮超高效液相色譜圖作為系膜細胞以及近曲小管上皮細胞細胞固相色譜法研究的

5、基礎。第二部分采用系膜細胞固相色譜法篩選丹皮與系膜細胞靶點結合的成分。系膜細胞膜上的靶位點與牡丹皮水提液中的效應成分特異性結合后，洗去未被細胞膜特異性結合的成分，最后使靶位點失活，使效應成分解離下來，將解離液進行色譜和質譜分析。實驗中對洗脫次數(shù)以及孵育時間等環(huán)節(jié)進行了探索和優(yōu)化，建立了系膜細胞固相色譜法，并篩選和確認了3個主要的準活性成分:芍藥苷（Paeoniflorin）、五沒食子酸葡萄糖(PGG1，2，3，4，6-penta-O-g

6、alloyl-β-D-glucose)、丹皮酚(Paeonol)。第三部分采用腎小管細胞膜固相色譜法篩選丹皮與腎小管細胞結合的成分。近曲小管上皮細胞膜上的靶位點與牡丹皮水提液中的效應成分特異性結合后，去除未結合成分，解離細胞膜結合成分，并對解離成分進行色譜分析。實驗中對洗脫次數(shù)以及孵育時間等環(huán)節(jié)進行了探索和優(yōu)化，建立了近曲小管上皮細胞固相色譜法，研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷、PGG、丹皮酚是丹皮中與腎小管上皮細胞結合的主要成分。第四部分對篩選出來的活