細(xì)胞固相色譜法研究牡丹皮中的效應(yīng)成分.pdf

1、細(xì)胞膜固相色譜法是用細(xì)胞膜作為固定相篩選藥物活性成分的方法，該方法可以直接有效地反映出藥物中活性成分與細(xì)胞膜上靶點的相互結(jié)合，最快捷有效的將藥物活性成分篩選與分離有機地結(jié)合在一起。細(xì)胞膜上有諸多的受體和其他藥物作用的靶位點，中藥能通過與細(xì)胞膜上的靶點結(jié)合而對其產(chǎn)生保護作用。由于中藥成分復(fù)雜，其保護作用的效應(yīng)成分不明確，如果中藥提取物具有保護細(xì)胞及防止損傷的作用，其中的效應(yīng)成分是通過與細(xì)胞膜上的受體和其他的靶位點結(jié)合而發(fā)揮作用的。在此基礎(chǔ)

2、上建立細(xì)胞膜固相色譜法，即模仿藥物與細(xì)胞結(jié)合的條件，使效應(yīng)成分與效應(yīng)靶點結(jié)合，再洗脫未結(jié)合的成分，再將與細(xì)胞結(jié)合的效應(yīng)成分從其結(jié)合的受體或靶位點上解離下來，這些效應(yīng)成分可用色譜-質(zhì)譜方法（如高效液相色譜-質(zhì)譜）進行研究分析，再驗證其中的準(zhǔn)效應(yīng)成分的藥理學(xué)活性。細(xì)胞膜固相色譜法是一種研究中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的新方法，該方法克服了以往成分分離與活性成分篩選脫節(jié)的弊端，它使活性成分的分離與篩選結(jié)合在一起，進而探討藥物的作用機理，是化學(xué)成分—效應(yīng)—

3、作用機理聯(lián)動的一種藥物研究方法，尤其適合于天然藥物活性成分的研究。丹皮是一味常用中藥，性微寒，味苦辛，無毒，入心、肝、腎經(jīng)，具有清血，活血散瘀的功能。丹皮常被用于治療腎病的中藥復(fù)方中，但是其保護和治療腎臟疾病的活性成分和作用機理并不清楚。系膜細(xì)胞與近曲小管上皮細(xì)胞是腎臟中重要的組成細(xì)胞，參與了各種腎臟病的病理過程，在腎病中具有重要的地位，因此本研究分別以腎小球系膜細(xì)胞和近曲小管上皮細(xì)胞的活性細(xì)胞膜作為固定相，采用細(xì)胞膜固相色譜法篩選丹皮

4、中保護腎臟的活性成分。
　　本研究分為四個部分：第一部分對中藥牡丹皮水提液進行研究，建立牡丹皮水提液的UPLC指紋圖譜，采用C18色譜柱，乙腈-0.1％的甲酸水為流動相梯度洗脫，流速為0.49ml/min，摸索最適檢測波長，確定檢測波長為254nm，柱溫為室溫。對不同批次的牡丹皮水提液進行指紋圖譜分析，通過UPLC-MS技術(shù)指認(rèn)指紋圖譜中主要峰的歸屬，得到的牡丹皮超高效液相色譜圖作為系膜細(xì)胞以及近曲小管上皮細(xì)胞細(xì)胞固相色譜法研究的

5、基礎(chǔ)。第二部分采用系膜細(xì)胞固相色譜法篩選丹皮與系膜細(xì)胞靶點結(jié)合的成分。系膜細(xì)胞膜上的靶位點與牡丹皮水提液中的效應(yīng)成分特異性結(jié)合后，洗去未被細(xì)胞膜特異性結(jié)合的成分，最后使靶位點失活，使效應(yīng)成分解離下來，將解離液進行色譜和質(zhì)譜分析。實驗中對洗脫次數(shù)以及孵育時間等環(huán)節(jié)進行了探索和優(yōu)化，建立了系膜細(xì)胞固相色譜法，并篩選和確認(rèn)了3個主要的準(zhǔn)活性成分:芍藥苷（Paeoniflorin）、五沒食子酸葡萄糖(PGG1，2，3，4，6-penta-O-g

6、alloyl-β-D-glucose)、丹皮酚(Paeonol)。第三部分采用腎小管細(xì)胞膜固相色譜法篩選丹皮與腎小管細(xì)胞結(jié)合的成分。近曲小管上皮細(xì)胞膜上的靶位點與牡丹皮水提液中的效應(yīng)成分特異性結(jié)合后，去除未結(jié)合成分，解離細(xì)胞膜結(jié)合成分，并對解離成分進行色譜分析。實驗中對洗脫次數(shù)以及孵育時間等環(huán)節(jié)進行了探索和優(yōu)化，建立了近曲小管上皮細(xì)胞固相色譜法，研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷、PGG、丹皮酚是丹皮中與腎小管上皮細(xì)胞結(jié)合的主要成分。第四部分對篩選出來的活