巨噬細胞固相色譜法的建立及其在蟲草免疫活性物質(zhì)研究中的應(yīng)用.pdf

1、中藥有幾千年的應(yīng)用歷史，臨床效果確切。然而長期以來，由于中藥的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)不明，臨床應(yīng)用多憑經(jīng)驗，造成中藥的質(zhì)量標準研究、作用機制研究、藥代動力學和毒理學研究等各項基礎(chǔ)研究變得十分困難，嚴重阻礙了中藥現(xiàn)代化。
　　 在效應(yīng)物質(zhì)的研究中，傳統(tǒng)方法是將中藥中的各種成分采用化學手段分離出來，然后逐一用動物模型驗證各個成分的效應(yīng)。這類方法步驟繁瑣、成本高、勞動強度大且成功率不高。有鑒于此，人們發(fā)展了各種高通量研究方法.這些方法包括80年

2、代的利用受體分子、酶等分離篩選中藥中的活性成分；90年代的分子生物色譜法，采用將人血清白蛋白等固定在色譜擔體中，研究藥物分子與生物大分子的相互作用；其后出現(xiàn)細胞膜生物色譜法、模擬生物膜色譜法、細胞生物色譜法，等等。將受體分子保留在完整的細胞膜中有利于維持生物大分子的活性，這是對分子生物色譜法的改進，由于在這些研究中，細胞膜或細胞仍然要固定在硅膠或凝膠顆粒中，因此也并非真正完整保持生物活性的細胞膜或活細胞。在這種情況下，我們發(fā)展了細胞(膜

3、)固相色譜法，同時滿足細胞(膜)的生物活性和色譜分離要求，用于研究中藥中的效應(yīng)物質(zhì)。
　　 本文第-部分第3點內(nèi)容，概述了本室這方面的研究工作情況。上述這些研究方法主要都是利用藥物分子與受體、酶等生物大分子的特異性親和作用來分離分析中藥中的效應(yīng)成分.由于受體等生物大分子的活性受環(huán)境的影響較大，因此越接近實際生理狀態(tài)的受體，其功能保存得越完全，在我們的研究中即在分析效應(yīng)成分的同時保證了細胞(膜)生存的環(huán)境。
　　 冬蟲夏草

4、是傳統(tǒng)的補益中藥，蟲草菌粉是從天然蟲草中分離出蟲草真菌，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵得到菌絲體，再經(jīng)過焙干研粉而得到的菌粉。一般認為，人工培養(yǎng)蟲草與天然蟲草的化學成分和藥理效應(yīng)相似，因此多將人工蟲草用作天然蟲草的代用品，用以緩解日漸緊張的天然蟲草資源?，F(xiàn)代的臨床和藥理學研究表明蟲草具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠作用于免疫系統(tǒng)的多個方面。但是，在文獻報道中經(jīng)常出現(xiàn)研究結(jié)果不太一致的情況，這可能與蟲草來源、制備方法、動物品系、模型生理病理狀態(tài)以及檢測手段不同

5、有關(guān)，可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果的不同，這使得蟲草的功效研究包括效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究陷入一定的困境。因此，如何采用既接近實際作用機制，又具有高效率的實驗研究方法，是效應(yīng)物質(zhì)研究中亟待解決的問題。效應(yīng)成分通常是作用于細胞上的效應(yīng)靶點發(fā)揮作用的，蟲草的效應(yīng)，可能是通過作用于免疫細胞發(fā)揮作用的；在各種免疫細胞中，巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境等多種功能，是機體非特異防御的基礎(chǔ).巨噬細胞

6、不僅是先天性免疫中重要的細胞群，在特異性獲得性免疫中也發(fā)揮著重要作用，可以說，巨噬細胞幾乎影響著免疫系統(tǒng)的方方面面.同時，巨噬細胞價廉易得，因此我們免疫活性成分的固相色譜研究中選擇了巨噬細胞。由于蟲草對免疫系統(tǒng)具有多方面的影響，因此可能會與巨噬細胞發(fā)生作用，文獻中也常出現(xiàn)蟲草及其提取物影響巨噬細胞吞噬功能的報道。以現(xiàn)代藥理學理論推測，蟲草中的某些效應(yīng)成分能夠作用于巨噬細胞上的受體，從而發(fā)揮效應(yīng)，影響巨噬細胞的功能活動。我們可以利用效應(yīng)成

7、分與巨噬細胞的這種結(jié)合作用，將它們從中藥提取物中分離出來，并結(jié)合一定的檢測和鑒定方法，明確這些成分.這是本論文第一部分中所闡述的假說形成過程。
　　 第二部分內(nèi)容重點講述巨噬細胞固相色譜的研究過程，是整部論文的核心.第二部分第一章中的內(nèi)容主要是采用RP-HPLC法，研究了十種蟲草樣品水提液的成分譜，確定了檢測波長260 nm、檢測時間30 min，優(yōu)化了其他色譜分析條件，考察了儀器分析的精密度。在確定的檢測方法下分析了蟲草樣品液

8、的成分譜，為下面進一步研究其中的效應(yīng)成分打下基礎(chǔ).在這些成分中，多數(shù)是核苷類成分，不同的蟲草樣品核苷的種類和含量是有差異的，根據(jù)比較分析，綜合考慮，我們選擇江西國藥的蟲草菌粉作為下一步研究的工具藥。第二章里探討了巨噬細胞分離效應(yīng)成分的可能性，建立巨噬細胞固相色譜法，研究免疫相關(guān)活性成分。研究采用蟲草提取液，觀察了其中幾種主要的核苷類成分與巨噬細胞的作用情況，發(fā)現(xiàn)兩種核苷可以被巨噬細胞明顯“固定”。在成分鑒定中，我們采用光譜掃描、標準品加

9、樣對照、質(zhì)譜分析，并結(jié)合文獻研究，確定這兩個成分是腺苷和鳥苷。腺苷是藥典中蟲草含量測定的指標性成分，而鳥苷不是，因此本方法在探索效應(yīng)成分，完善中藥質(zhì)量標準方面體現(xiàn)了應(yīng)用前景。為了進一步明確這種結(jié)合作用，同時避免中藥提取物中無關(guān)成分的干擾，我們采用了核苷標準品進行實驗；為了研究不同種屬的巨噬細胞，我們還進行了小鼠巨噬細胞的“固相”研究，結(jié)果顯示：標準品與蟲草樣品溶液中的相應(yīng)核苷類成分均能與巨噬細胞發(fā)生，大鼠和小鼠的巨噬細胞研究結(jié)果也相似。

10、被結(jié)合成分的效應(yīng)如何將在后面的效應(yīng)實驗中加以驗證，為了排除生物膜的非特異性吸附作用，第三章里我們選擇SMMC-7721人肝癌細胞株、熱處理巨噬細胞、紫外線照射細胞以及拮抗劑茶堿作用后的細胞進行結(jié)合作用研究。研究結(jié)果表明：相關(guān)核苷類成分在所考察時間內(nèi)不與SMMC-7721細胞發(fā)生明顯結(jié)合作用，這可能是與細胞受體種類不同有關(guān)；這些核苷類成分也不與或極少與熱處理巨噬細胞和紫外線照射細胞發(fā)生結(jié)合作用，這可能與細胞受損后受體活性降低有關(guān)，而腺苷受

11、體拮抗劑茶堿可以很明顯的拮抗蟲草中腺苷的結(jié)合作用。第四章，我們研究了前述被巨噬細胞“固定化”的成分對巨噬細胞功能的影響。巨噬細胞能夠分泌多種細胞因子，這些細胞因子的改變也能夠反映巨噬細胞功能活動的變化，因此在本章第一節(jié)中我們采用ELISA方法檢測TNF-α、IL-1β，采用Griess法檢測NO等方法，觀察“固定”核苷成分與巨噬細胞共培養(yǎng)后對巨噬細胞功能活動的影響。由于天然蟲草與人工蟲草的含量差異，因此我們同時評價了不同比例核苷的效應(yīng)，

12、結(jié)果腺苷和鳥苷更多的表現(xiàn)出來的是對巨噬細胞的抑制效應(yīng)，而尿苷有輕微的激活效應(yīng)；還證明了核苷類成分即便種類相同，如果含量比例不同，對細胞也會產(chǎn)生不同的作用。第四章第二節(jié)觀察了腺苷、鳥苷和尿苷對巨噬細胞吞噬功能的影響，結(jié)果腺苷和鳥苷仍然表現(xiàn)抑制作用而尿苷有輕微促進作用，
　　 第三部分對本研究的思路形成過程、假說的提出和論證過程進行了討論，對下一步工作進行了展望，并涉及關(guān)于現(xiàn)有方法的一些存在問題。同時，對于如何實現(xiàn)細胞固相過程與儀器