E-鈣粘素在大鼠阿霉素腎病動(dòng)物模型中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：E-鈣粘素(E-cadherin)是鈣依賴性細(xì)胞間連接的細(xì)胞粘附分子之一，主要存在于人和動(dòng)物的上皮細(xì)胞中，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接。其在腎內(nèi)分泌的不平衡，可造成腎小球足細(xì)胞和基底膜連接的損害，使足細(xì)胞從腎小球基底膜上脫落。本研究建立大鼠阿霉素腎病（adriamycin-induced nephropathy ）模型，通過組織病理學(xué)觀察、免疫組化和RT-PCR 方法，動(dòng)態(tài)觀察腎小球足細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，探討E-c

2、adherin 變化在腎小球疾病中的作用及臨床意義。
　　 方法：1.阿霉素腎病動(dòng)物模型的建立：選取清潔級(jí)雄性SD 大鼠84 只，隨機(jī)分為兩組：
　　 對(duì)照組、阿霉素腎病組，腎病組大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射阿霉素注射液（濃度2mg/ml，7.5mg/kg 劑量），復(fù)制阿霉素腎病模型；正常對(duì)照組尾靜脈一次性注射等體積的生理鹽水。各組大鼠分別于建模后第1 周、2 周、3 周、4 周、6 周、8 周、12 周宰殺，每組各6 只，留

3、取腎臟標(biāo)本，處死前于大鼠內(nèi)眥靜脈采血約3ml，離心分離血清測(cè)血漿白蛋白、尿素氮、肌酐。大鼠處死前1天代謝籠收集24 小時(shí)尿液，測(cè)24 小時(shí)尿蛋白定量。2.電鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)行HE、Masson、PAS染色，光鏡下觀察腎臟病理改變情況。3.采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿白蛋白，采用磺基水楊酸法測(cè)24 小時(shí)尿蛋白定量，分析各組間血漿白蛋白、24 小時(shí)尿蛋白的變化。4.用免疫組化技術(shù)檢測(cè)E-cadherin、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP

4、-9 ）和纖維連接蛋白（FN ）在阿霉素腎病模型腎小球內(nèi)的表達(dá)，分析不同時(shí)間點(diǎn)各組間E-cadherin、MMP-9、FN 在腎小球內(nèi)的表達(dá)情況，探討其表達(dá)量與腎小球足細(xì)胞損傷程度之間的關(guān)系；5. RT-PCR 方法檢測(cè)腎皮質(zhì)內(nèi)E-cadherin的mRNA的表達(dá)，從分子水平探討E-cadherin與腎小球疾病的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1.阿霉素腎病組大鼠前4 周均出現(xiàn)大量蛋白尿、低蛋白血癥，第4 周電鏡下可見腎小球足突廣泛融合，與

5、臨床微小病變性腎病相似；第8 周部分腎小球發(fā)生局灶性硬化，與臨床局灶節(jié)段性硬化相似；2.與對(duì)照組相比，腎病組24 小時(shí)尿蛋白定量從第1 周開始增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，尿蛋白有逐漸增加的趨勢(shì)，同時(shí)腎病組血漿白蛋白從第1 周開始下降，呈時(shí)間依賴性遞減，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01 ）；前4周腎病組大鼠血尿素氮、肌酐無明顯變化，第6 周末升高，隨著實(shí)驗(yàn)周數(shù)的增加，升高更明顯，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，12 周末達(dá)最大值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義（p<0.05）；3.腎組織形態(tài)學(xué)與病理學(xué)改變：腎病組大鼠腎臟體積稍大，顏色深紅，切面皮髓質(zhì)分界也清楚，電鏡可見腎小球足突融合或消失，有微絨毛的形成；光鏡下顯示：前2 周腎小球無改變，腎小管可見脂肪變性，隨著病程進(jìn)展，足細(xì)胞腫脹明顯，并有小新月體形成及球囊壁纖維化，8 周時(shí)出現(xiàn)系膜細(xì)胞輕度增生，部分大鼠有腎小球毛細(xì)血管襻節(jié)段性硬化伴腎小管萎縮；隨著病情進(jìn)展病變加重；4.免疫組化：① E-cadherin的表達(dá)：與對(duì)照組相比，腎病模型組

7、第3 周時(shí)E-cadherin 在腎小球內(nèi)足細(xì)胞的表達(dá)開始下降，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減少，12 周最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01 ）；② MMP-9的表達(dá)：MMP-9在腎小球的表達(dá)主要位于足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，與對(duì)照組相比，腎病組第1 周末表達(dá)開始上調(diào)，第3 周末達(dá)高峰（p<0.01 ），后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05 ）；③ FN的表達(dá)：在腎病組第1 周，F(xiàn)N的表達(dá)輕度上調(diào)，隨著實(shí)驗(yàn)周

8、數(shù)的增加，F(xiàn)N 在腎小球系膜區(qū)內(nèi)的表達(dá)逐漸增加，12 周達(dá)高峰，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01 ）；5. RT-PCR: 腎組織E-cadherin的mRNA 表達(dá)從第3 周開始減少，至第12 周降至正常組的1/5，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；
　　 6. 相關(guān)分析結(jié)果顯示：隨著病變進(jìn)展，E-cadherin 及其mRNA 在腎小球足細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)逐漸減少，F(xiàn)N 在腎小球系膜區(qū)的表達(dá)逐漸增加，MM

9、P-9 在FSGS 階段在腎小球足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)逐漸減少，E-cadherin和FN 表達(dá)量之間呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.926，p<0.001 ），和MMP-9 在FSGS 階段的表達(dá)量之間呈高度正相關(guān)（r=0.915，p<0.001 ）；
　　 MMP-9和FN 在FSGS 階段的表達(dá)量之間呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.949，p<0.001 ），24 小時(shí)尿蛋白定量與E-cadherin、E-cadherin mRNA 之間

10、呈負(fù)相關(guān)（r=-0.747/-0.742，p<0.01 ），與FN 表達(dá)量之間呈正相關(guān)（r=0.812，p<0.01 ）。
　　 結(jié)論：1.E-cadherin、E-cadherin的mRNA 在腎內(nèi)表達(dá)的減少，與足細(xì)胞病變密切相關(guān)，它參與了足細(xì)胞病中腎臟損傷及腎小球硬化的病理過程，E-cadherin的表達(dá)減少可能是腎損傷早期預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；E-cadherin 從mRNA 水平參與了足細(xì)胞損傷的病理生理過程；
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