柚皮甙復(fù)合BMSCs移植治療股骨頭缺血性壞死的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的：（1）探討柚皮甙能否誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化。
　?。?）探討內(nèi)臵氯化鋅致股骨頭缺血性壞死的機(jī)制及可行性。
　?。?）探討柚皮甙誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合同種異體松質(zhì)骨載體在兔體內(nèi)修復(fù)壞死股骨頭的作用機(jī)制。
　?。?）為柚甙成為新藥提供理論支持。
　　方法：體外實(shí)驗(yàn)：以新生兔的第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、鑒定,掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一般生長(zhǎng)規(guī)律及環(huán)境。隨后取同批骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞擴(kuò)增至第三代后種植于12孔板，分別用柚皮甙誘導(dǎo)液、成骨誘導(dǎo)液、柚皮甙成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組；取成年兔髂骨脫蛋脫脂處理后，檢測(cè)其生化指標(biāo)，以備用。同種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以2.3-2.5公斤的新西蘭大白兔為研究對(duì)象，經(jīng)股骨頸骨隧道臵6.5mg、7.5 mg的氯化鋅入股骨頭內(nèi)致缺血性壞死，待造模穩(wěn)定后。選同批號(hào)2.3-2.5公斤新西蘭大白兔21只分5mg、6.5mg、7.5 mg三組，所有動(dòng)物均右側(cè)造模

3、，左側(cè)空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，于第2、14、28、42天拍攝 x線片、處死做組織病理學(xué)切片，確定致股骨頭壞死的最佳劑量及壞死與修復(fù)的臨界點(diǎn)及最佳內(nèi)臵劑量。待造模成功后，選同批號(hào)2.3-2.5公斤新西蘭大白兔20只以最佳內(nèi)臵劑量為標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一造模，3周后刮除壞死灶，分別植入單純松質(zhì)骨載體（對(duì)照組）、BMSCs復(fù)合松質(zhì)骨載體復(fù)合物（實(shí)驗(yàn)組），空白組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。分別于術(shù)后第4、8、12周拍攝X線片、處死做組織病理學(xué)觀察，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件

4、對(duì)相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：①BMSCs輪廓呈長(zhǎng)梭形，少量細(xì)胞呈星形，胞漿豐富，常有1-2個(gè)細(xì)胞核，位臵居中成成纖維樣生長(zhǎng)。消化傳代后，細(xì)胞透亮呈圓形，2-4小時(shí)后貼壁生長(zhǎng)，變成短梭形，1-2天后細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶底，呈長(zhǎng)梭形分散排列。可向多方向誘導(dǎo)分化，經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，形體飽滿，體積逐漸增大；柚皮甙誘導(dǎo)3周后，培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)堿性磷酸酶、鈣化結(jié)節(jié)和I性膠原免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)。成骨誘導(dǎo)液與柚皮甙在誘導(dǎo) BMSCs

5、向成骨分化方面沒(méi)有明顯的差異性（P>0.05)，成骨誘導(dǎo)液復(fù)合柚皮甙亦無(wú)明顯的增強(qiáng)或減弱；
　?、?.5mg氯化鋅在臵入1周后骨細(xì)胞開(kāi)始?jí)乃溃?周時(shí)壞死的骨小梁表面及壞死骨周?chē)写罅啃律切纬桑律?、壞死骨相混雜，新生骨內(nèi)細(xì)胞胞漿豐富，胞核大，說(shuō)明其代謝非?；钴S。比較符合人類(lèi)股骨頭壞死的病理過(guò)程；
　?、壑Ъ懿牧先S孔隙結(jié)構(gòu)保留完好,材料的孔徑約為300μm，孔隙率約為82.3％。具有原始骨組織的三維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的的生長(zhǎng)提

6、供了一個(gè)利于細(xì)胞黏附、增殖、分化及誘導(dǎo)的正常表達(dá)場(chǎng)所。BMSCs不僅能與生物骨衍生支架黏附，而且能在支架上分裂、增殖，體現(xiàn)了良好的生物相容性和細(xì)胞-材料界面作用。
　?、苤踩胫Ъ懿牧?周后周邊新骨帶明顯增寬，成骨反應(yīng)向中心部推進(jìn)，植入物表面有大量骨痂形成，與骨端連接緊密，少部分標(biāo)本形成連續(xù)性骨橋。12周，部分充填區(qū)被幼稚的骨小梁所占據(jù)，部分充填區(qū)廣布相對(duì)成熟的骨小梁，但較正常骨小梁粗、排列不夠規(guī)則，骨痂形成，可見(jiàn)植入物完全骨化，缺

7、損區(qū)完全被新骨代替。
　　結(jié)論：①BMSCs在不同的誘導(dǎo)劑作用下，可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化。在向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，分化的細(xì)胞富含堿性磷酸酶，能合成Ⅰ型膠原表達(dá)素和骨橋蛋白，并可形成鈣化結(jié)節(jié)。
　?、诼然\在腔室內(nèi)溶解，能夠殺滅滲透區(qū)域內(nèi)的成骨細(xì)胞及骨髓細(xì)胞，可造成一定區(qū)域的骨壞死，再現(xiàn)股骨頭壞死后的一系列病理生理過(guò)程，可造一定區(qū)域性骨壞死病理模型。
　?、蹅涞耐N異體脫蛋白、脫脂松質(zhì)骨載體，材料來(lái)源廣泛