2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、耳聾是引起交流障礙最常見的疾病。在常染色體隱性遺傳性聾中,約50%以上耳聾是由GJB2(CX26)基因缺陷所致,其中白種人最常見的突變是35del G,東亞人最常見的突變是235delC,該基因突變還與常染色體顯性遺傳性聾和遺傳性綜合征性聾有關(guān),是最重要的耳聾基因。CX26(Connexin26)是間隙連接蛋白家族中的一員。間隙連接通道(Gap Junctional Channels,GJCh)是間隙連接蛋白在相鄰細胞膜上組成的一種細胞

2、膜性通道,能允許離子(ionic coupling,離子耦聯(lián))、或諸如分子量<1000 Da的代謝產(chǎn)物和第二信使分子等小分子物質(zhì)(biochemical coupling,生化耦聯(lián))交換通過。生物體通過這種通道進行物質(zhì)和信息交換,使得細胞對內(nèi)外環(huán)境的刺激作出協(xié)調(diào)一致的反應(yīng),對細胞的新陳代謝、增殖和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程起著重要的調(diào)控作用。GJCh的功能分析包括離子耦聯(lián)和生化耦聯(lián)兩個方面的分析。
   目的:探討CX26不同結(jié)

3、構(gòu)域上的各1個點突變(S19T、E47K、V84L、V95M、R165W、R32H、R143W、S199F和L214P),及導(dǎo)致不同長度截短蛋白的突變(35del G、235delC、572delT、465 T→A(Y155X)和631—632delGT)在體外真核細胞內(nèi)的表達、定位和間隙連接功能的改變;尤其是對CX26的6個在國際上還沒有功能研究報道的突變(R32H、R165W、S199F、572delT、465T→A和631—632

4、delGT)在體外真核細胞表達載體分析突變蛋白功能的變化。本文中的5個截短蛋白突變的共同點是CX26的羧基端(C端)缺失,5個截短蛋白突變的分析可能反應(yīng)C端對CX26運輸、定位和間隙連接功能的作用。本研究旨在為分析GJB2基因突變致聾的分子機制、及為防治該基因缺陷所致的耳聾奠定理論基礎(chǔ)。
   方法:從CX26的9個結(jié)構(gòu)域各選1個致聾點突變(錯義突變),及5個導(dǎo)致不同長度截短蛋白的移碼或無義突變,其中包括我國最常見的突變235d

5、elC,高加索人群中最常見的突變35delG,我們以前發(fā)現(xiàn)的一個新突變Y155X,以及572delT和631-632delGT,分別用Overlap法和長引物法快速構(gòu)建CX26基因的這14個致聾突變體(p.S19T、p.R32H、p.E47K、p.V841L、 p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F、p.L214P、c.35delG、c.235delC、p.Y155X、c.572delT和c.631-632delG

6、T),將各突變體及野生型CX26分別裝入pEGFP-N1質(zhì)粒。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa細胞,Western印跡分析突變型和野生型CX26在HeLa細胞的表達,熒光顯微鏡下初步觀察CX26突變蛋白和野生型蛋白在HeLa細胞的表達和定位后,進一步用共聚焦顯微鏡觀察CX26突變蛋白和野生型蛋白的定位及在細胞膜上有無間隙連接斑樣結(jié)構(gòu)形成。對無間隙連接斑樣結(jié)構(gòu)形成的突變體,再對轉(zhuǎn)染的HeLa細胞的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色進行染色標記,共聚焦顯微鏡下觀察突變

7、蛋白是否定位于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng),了解突變蛋白的亞細胞定位。對能形成間隙連接斑的突變體采用calcein染料轉(zhuǎn)移實驗分析所形成的間隙連接通道的生化耦聯(lián)功能。
   結(jié)果:通過overlap法成功構(gòu)建了p.R32H、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F及c.35delG突變體;通過長引物法成功構(gòu)建了p.S19T、p.L214P、c.235delC、p.Y155X、c.572delT

8、及c.631-632delGT突變體。Western印跡檢測結(jié)果顯示,c.35delG突變體在HeLa細胞無突變蛋白的表達,其他13個突變蛋白在HeLa細胞都有表達。p.S19T、p.R32H、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R143W、p.R165W、p.S199F和p.L214P突變蛋白的分子量大小與野生型CX26基本相同,c.235delC、p.Y155X、c.572delT及c.631-632delGT突變蛋白的分

9、子量小于野生型,為截短蛋白。p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M、p.R165W突變蛋白主要定位在細胞膜上,聚集成間隙連接斑樣結(jié)構(gòu)。p.R32H、p.R143W、p.S199F、p.L214P、c.235delC、p.Y155X、c.572delT、c.631-632delGT突變蛋白在細胞內(nèi)呈彌散分布,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體染色部位無突變蛋白分布,在細胞膜上觀察不到突變蛋白表達。Calcein染料轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)p.

10、V84L在HeLa細胞上形成的突變蛋白間隙連接和野生型CX26間隙連接具有Calcein染料轉(zhuǎn)移功能,無顯著性差異。而p.S19T、p.E47K、p.V95M、p.R165W突變蛋白在HeLa細胞形成的間隙連接不能進行calcein染料轉(zhuǎn)移。
   結(jié)論:CX26的p.R32H、p.R143W、p.S199F和p.L214P錯義突變體,及c.235delc、p.Y155X、c.572delT和c.631-632delGT截短蛋白

11、突變體在體外真核細胞表達載體HeLa細胞不能運輸至細胞膜上形成間隙連接,突變蛋白主要表達和定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),提示這8個突變蛋白喪失了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到細胞膜的功能。4個不同大小的截短蛋白(c.235delC、c.465 T→A、c.572delT和c.631-632delGT)均不能運輸至質(zhì)膜,提示其共同缺失的C端對CX26的運輸可能具有重要意義。p.S19T、p.E47K、p.V84L、p.V95M和p.R165W突變體在HeLa細胞表達后能

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