醋甲唑胺對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血小鼠神經(jīng)功能損害及神經(jīng)元凋亡的影響.pdf

1、研究目的：
　　1、通過神經(jīng)病學(xué)評(píng)分及曠場試驗(yàn)，探討醋甲唑胺對(duì)SAH小鼠的感覺運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能的影響。
　　2、通過FJB染色及TUNEL法檢測出血側(cè)腦皮層及海馬的變性和凋亡神經(jīng)元的變化，探討醋甲唑胺對(duì)SAH小鼠神經(jīng)元凋亡的影響。
　　3、通過免疫組織化學(xué)和western blot檢測醋甲唑胺對(duì)SAH后凋亡關(guān)鍵分子caspase-3蛋白的影響，初步探討醋甲唑胺處理影響SAH后神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制。
　　研究方法：<

2、br>　　1．小鼠SAH模型的建立及分組
　　雄性C57BL/6J小鼠（25-30g）隨機(jī)分為假手術(shù)組、未用藥組及醋甲唑胺組。用血管內(nèi)插線法建立小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，激光多普勒血流儀記錄血流量的變化。假手術(shù)組穿刺過程僅感到阻力但不穿破血管。醋甲唑胺組術(shù)后30分鐘開始腹腔注射醋甲唑胺（20mg/kg），以后每12小時(shí)注射一次，一般用藥至處死的各時(shí)相點(diǎn)，最長不超過72小時(shí)。其余兩組在相同時(shí)相注射等量的PBS。
　　2.蛛網(wǎng)膜下

3、腔出血程度的判定
　　對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有需術(shù)后24小時(shí)處死的小鼠進(jìn)行出血評(píng)分。術(shù)后24h處死小鼠并快速取腦，照相機(jī)拍攝腦基底池部出血情況，根據(jù)Sugawara等報(bào)道的方法進(jìn)行出血等級(jí)判定。
　　3．神經(jīng)功能損害評(píng)分
　　假手術(shù)組選5只小鼠作為對(duì)照，其余每組隨機(jī)抽取9只進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分及曠場試驗(yàn)。神經(jīng)功能評(píng)價(jià)采用Garcia評(píng)分系統(tǒng)，總分為5—18分。
　　4.認(rèn)知功能評(píng)價(jià)
　　分別在術(shù)后第3d、7d、14d進(jìn)行

4、曠場試驗(yàn)。每次試驗(yàn)記錄小鼠在曠場內(nèi)5 min的行為表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析其運(yùn)動(dòng)總距離及中央格時(shí)間。
　　5.腦水腫的檢測
　　假手術(shù)組選5只小鼠作為對(duì)照，其余每組隨機(jī)抽取9只，SAH后24h，麻醉后斷頭處死取腦，迅速秤重，隨后放置在烤爐內(nèi)，100℃烘烤24小時(shí)，再秤重。以公式計(jì)算含水量：(濕重一干重)／濕重×100％。
　　6.腦血管痙攣的檢測
　　每組隨機(jī)抽取8只小鼠。手術(shù)后24h處死小鼠，采用印度墨水/明膠灌注固定腦

5、血管，照相后用Image J軟件進(jìn)行腦血管直徑的檢測及比較。
　　7．FJB及TUNEL法檢測神經(jīng)元的變性和凋亡
　　每組隨機(jī)抽取9只小鼠，手術(shù)后24h，中性多聚甲醛行腦血管灌注后取腦，固定后石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片后FJB法檢測大腦皮層及海馬區(qū)變性壞死神經(jīng)元的比例；TUNEL法檢測大腦皮層及海馬細(xì)胞凋亡的變化。
　　8.免疫組織化學(xué)方法檢測大腦皮層及海馬區(qū)的活化型caspase-3的表達(dá)及分布情況。
　　9. W

6、estern blot法檢測腦組織caspase-3蛋白的表達(dá)，用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析。
　　10.所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1. SAH總死亡率為25.3%，其中假手術(shù)組無死亡，未用藥組26.1%，醋甲唑胺組24.4%，未用藥組與醋甲唑胺組死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

7、異(p＞0.05)
　　2.出血程度方面，假手術(shù)組無出血；未用藥組的蛛網(wǎng)膜下腔出血評(píng)分為8.50±2.17，醋甲唑胺組為8.09±1.81，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。腦血流量方面，未用藥組和醋甲唑胺組手術(shù)過程中各時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.神經(jīng)病學(xué)評(píng)分，假手術(shù)組24h、48h、72h分別為17.5±0.55、18、18，未用藥組分別為10.33±2.55、12.56±2.13、14.11±2.2

8、6，醋甲唑胺組分別為12.67±2.00、14.67±1.66、16.00±1.00，三組組間各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。24h、48h、72h醋甲唑胺組好于未用藥組小鼠(P　　4.假手術(shù)組3d、7d及14d的曠場試驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離及中央格時(shí)間與未用藥組及醋甲唑胺組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。醋甲唑胺組各時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)總距離及中央格時(shí)間較未用藥組改善明顯（p＜0.05）；
　　5.在出血側(cè)大腦半球，醋甲唑胺組腦含水量(77

9、.78%±0.43%)較未用藥組腦含水量(78.27%±0.48%)減少(P<0.05)；
　　6.三組的大腦前及頸內(nèi)動(dòng)脈直徑比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。未用藥組(87.11±6.73)及醋甲唑胺組(89.39±7.22)的大腦中動(dòng)脈直徑較假手術(shù)組的大腦中動(dòng)脈直徑(106.89±8.66)明顯變小(PO.05)；
　　7.假手術(shù)組偶見FJB陽性細(xì)胞，醋甲唑胺組出

10、血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)FJB陽性細(xì)胞數(shù)(40×)分別為30.89±7.08、16.33±7.77，與未用藥組(42.64±11.58、31.55±4.95)比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；
　　8.假手術(shù)組偶見TUNEL陽性細(xì)胞，醋甲唑胺組出血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞(40×)比值分別為12.14%±8.33%、10.42%±12.92%，與未用藥組(25.84%±9.66%、23.60±7.22%)比較明顯

11、降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；
　　9.假手術(shù)組偶見caspase-3免疫陽性表達(dá)于胞漿；醋甲唑胺組出血側(cè)腦皮層及海馬區(qū)caspase-3陽性細(xì)胞(40×)比值分別為20.64%±10.93%、23.67%±9.77%，與未用藥組(44.57%±8.50%、41.96%±16.90%)比較明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；
　　10.免疫蛋白印跡結(jié)果顯示，假手術(shù)組無 caspase-3表達(dá)（0.751±0.

12、001），未用藥組caspase-3表達(dá)明顯（0.916±0.089），醋甲唑胺組caspase-3表達(dá)為0.758±0.007，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.醋甲唑胺可減輕SAH后的腦水腫，抑制腦皮層和海馬神經(jīng)元的變性凋亡，早期可改善SAH小鼠的神經(jīng)功能，遠(yuǎn)期可改善SAH小鼠的認(rèn)知功能。
　　2.醋甲唑胺可能通過抑制凋亡關(guān)鍵分子caspase-3的活化表達(dá)，抑制神經(jīng)元的凋亡，從而對(duì)SAH后的腦損