地塞米松拮抗聲損傷及慶大霉素耳毒性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、噪聲性聾及藥物性聾是常見的感音神經(jīng)性聾,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。長(zhǎng)期以來,對(duì)聲損傷和慶大霉素耳毒性的防治一直是廣大耳科工作者致力研究的課題。地塞米松作為合成的糖皮質(zhì)激素,具有多種生理功能。已有研究發(fā)現(xiàn),地塞米松能減小噪聲及氨基甙類藥物的耳毒性,但對(duì)這一現(xiàn)象機(jī)制的研究少有報(bào)道。
　　 地塞米松作為糖皮質(zhì)激素,通過基因組途徑及非基因組途徑發(fā)揮作用。在基因組途徑中,地塞米松通過與位于胞漿的糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid

2、receptor,GR)結(jié)合,進(jìn)而影響某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),因此了解GR在耳蝸的的分布很有必要。既往的研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、原位雜交、免疫組織化學(xué)方法研究糖皮質(zhì)激素在內(nèi)耳的分布,而應(yīng)用直觀的免疫熒光技術(shù)分析GR在耳蝸的分布及聲損傷對(duì)GR表達(dá)的影響還未見報(bào)道。
　　 Notch信號(hào)系統(tǒng)幾乎涉及所有細(xì)胞的增殖、分化活動(dòng),Hes1(hairy and enhaiicer of split 1)為Notch的基本效應(yīng)因

3、子。Hes1mRNA表達(dá)水平增高提示Notch信號(hào)活化,導(dǎo)致CDK(Cyclin-dependent kinases,周期性蛋白依賴激酶)抑制物p21Wafl/Cip的聚集,而后者與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。噪聲、地塞米松與hes 1 mRNA表達(dá)的關(guān)系可能是地塞米松拮抗聲損傷的機(jī)制之一,對(duì)這一現(xiàn)象未見相關(guān)報(bào)道。
　　 地塞米松拮抗氨基甙類抗生素耳毒性的在體研究已有報(bào)道,離體實(shí)驗(yàn)避免了全身因素的干擾和影響,使研究途徑更加便捷可靠。觀察地

4、塞米松是否拮抗慶大霉素對(duì)體外培養(yǎng)的Corti器的耳毒性,尚未見報(bào)道。
　　 抑制外毛細(xì)胞Ca2+敏感的外向K+電流可能是氨基甙類抗生素耳毒性的機(jī)制之一,地塞米松是否通過非基因組途徑影響該電流,從而拮抗慶大霉素耳毒性,尚未見報(bào)道。
　　 因此,本研究的主要目的是探討地塞米松對(duì)聲損傷及慶大霉素耳毒性的影響及相關(guān)機(jī)制。以免疫熒光技術(shù)定位,熒光強(qiáng)度半定量分析為指標(biāo),探討了糖皮質(zhì)激素受體在豚鼠耳蝸的分布,聲損傷后對(duì)其分布及各區(qū)域表

5、達(dá)強(qiáng)度的影響。以聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR),耳蝸形態(tài)學(xué)為指標(biāo)探討地塞米松減輕耳蝸聲損傷的作用;用RT-PCR及熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),探討噪聲及地塞米松對(duì)豚鼠耳蝸hes 1 mRNA表達(dá)水平的影響。以免疫熒光技術(shù)定位,耳蝸形態(tài)學(xué)毛細(xì)胞計(jì)數(shù)為指標(biāo),探討地塞米松減輕慶大霉素對(duì)離體培養(yǎng)的耳蝸Cord器的毒性作用。以聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)為指標(biāo)探討地塞米松減輕慶大霉素耳毒性的作用;應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)探討慶大霉素耳毒性及地塞米松拮抗慶大

6、霉素耳毒性的離子通道機(jī)制。
　　 第一部分地塞米松拮抗內(nèi)耳聲損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　 一、糖皮質(zhì)激素受體在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對(duì)其表達(dá)的影響
　　 目的:研究GR在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對(duì)豚鼠耳蝸GR表達(dá)的影響。
　　 方法:豚鼠隨機(jī)分為二組:實(shí)驗(yàn)組予噪聲暴露,噪聲為白噪聲,強(qiáng)度115dBSPL,暴露時(shí)間3h。暴露結(jié)束后2h斷頭剝?nèi)《?。正常?duì)照組不做處理,與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)剝?nèi)《仭Ｖ苽涠伇鶅銮衅?免疫熒光技

7、術(shù)觀察豚鼠耳蝸GR表達(dá)情況,并進(jìn)行熒光強(qiáng)度半定量分析。
　　 結(jié)果:(1)豚鼠耳蝸GR主要的陽(yáng)性部位在螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋唇、Corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)。螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋唇以及螺旋神經(jīng)節(jié)等區(qū)域GR熒光強(qiáng)度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而上述各區(qū)域與Corti器的GR熒光強(qiáng)度相比,差異有顯著意義(P＜0.05)。(2)聲損傷后豚鼠耳蝸GR熒光強(qiáng)度在骨螺旋唇、corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)較正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

8、.05),而螺旋韌帶、血管紋區(qū)域熒光強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯減低,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:GR在豚鼠耳蝸分布于螺旋韌帶、血管紋、corti器和螺旋神經(jīng)節(jié),其中螺旋韌帶、血管紋區(qū)域表達(dá)最強(qiáng),corti器區(qū)域表達(dá)最弱;聲損傷降低耳蝸各區(qū)域GR的表達(dá),以血管紋、螺旋韌帶最顯著。
　　 二、地塞米松拮抗耳蝸聲損傷及對(duì)豚鼠耳蝸hes1表達(dá)水平的影響
　　 目的:探討地塞米松拮抗聲損傷及與耳蝸hes1mR

9、NA的表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法:在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,豚鼠隨機(jī)分為5組,空白對(duì)照組,NSipqd+植物油imqd;噪聲組(N),NSipqd+植物油imqd+噪聲暴露;地塞米松+噪聲組(Dex+N),Dexipqd+植物油imqd+噪聲暴露;RU486+噪聲組(RU+N),NSipqd+RU486imqd+噪聲暴露;地塞米松+RU486+噪聲組(Dex+RU+N),Dexipqd+RU486imqd+噪聲暴露。其中地塞米松劑量1mg

10、/kg,濃度0.5mg/ml;RU486劑量20mg/kg,濃度25mg/ml。藥物作用時(shí)間均為5d。噪聲暴露于白噪聲3小時(shí),強(qiáng)度115dBSPL。噪聲暴露結(jié)束即刻處死。取下顳骨,冰盒中取出耳蝸,用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time-PCR)檢測(cè)耳蝸組織hes1mRNA的表達(dá)。同樣分組條件下,在噪聲暴露前、噪聲暴露結(jié)束后24小時(shí)測(cè)定Crick和短純音(2、4、6、8kHz)ABR反應(yīng)閾值,空白對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束各測(cè)定一次ABR。

11、各組動(dòng)物進(jìn)行耳蝸NBT染色及基底膜鋪片。
　　 結(jié)果:(1)白噪聲115dBSPL,暴露3h,促進(jìn)豚鼠hes1 mRNA表達(dá)增加約3倍;地塞米松預(yù)處理5d,可以使hes1mRNA表達(dá)水平接近于對(duì)照組。Dex-RU486-noise組hes1 mRNA表達(dá)水平接近于noise組,說明RU486基本上阻斷了地塞米松下調(diào)豚鼠耳蝸hes1 mRNA表達(dá)水平的作用。(2)各組ABR平均閾移:空白對(duì)照組閾移為0.5～1.40dB:噪聲組cl

12、ick閾移為29.56dB,短純音(2、4、6、8kHz)閾移為32.75～34.78dB;地塞米松+噪聲組click閾移為11.46dB,短純音(2、4、6、8kHZ)閾移為12.75～15.85dB;RU486+噪聲組click閾移為26.93dB,短純音(2、4、6、8kHz)閾移為30.15～33.26dB;地塞米松+RU486+噪聲組click平均閾移為27.38dB,短純音2、4、6、8kHz閾移為30.26～33.52dB

13、。噪聲組、地塞米松+RU486+噪聲組分別與地塞米松+噪聲組相比,全頻的ABR閾移均有顯著性差異(p＜0.05)。(3)耳蝸基底膜NBT染色顯示噪聲組底回?fù)p傷較重,地塞米松+噪聲組損傷輕微。
　　 結(jié)論:地塞米松對(duì)耳蝸聲損傷具有拮抗作用;下調(diào)耳蝸hes1 mRNA的表達(dá)水平,減少細(xì)胞凋亡,可能是地塞米松對(duì)聲損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。
　　 第二部分地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性的實(shí)驗(yàn)研究
　　 一、地塞米松拮抗慶大

14、霉素耳毒性作用的離體實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:采用Corti器體外培養(yǎng)的方法,觀察地塞米松是否對(duì)慶大霉素的耳蝸毒性具有拮抗作用。
　　 方法:成功建立耳蝸Corti器體外培養(yǎng)系統(tǒng)后,選取出生3d的SD大鼠,隨機(jī)分為3組,正常對(duì)照(Control)組,進(jìn)行Corti器體外培養(yǎng),72h后中止培養(yǎng);慶大霉素(GM)組,培養(yǎng)48h后加入慶大霉素液(濃度0.5mmol/L),作用24h后中止培養(yǎng);地塞米松+慶大霉素(Dex+GM)組,

15、培養(yǎng)24h后加入地塞米松溶液(濃度100ng/mL),培養(yǎng)48h后加入慶大霉素液(濃度0.5mmol/L),培養(yǎng)72h后中止培養(yǎng)。各組中止培養(yǎng)后,Rhodamine-phalloidin染色,免疫熒光技術(shù)觀察Corti器毛細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
　　 結(jié)果:正常對(duì)照(Control)組毛細(xì)胞無明顯缺失;慶大霉素(GM)組外毛細(xì)胞有明顯缺失,而內(nèi)毛細(xì)胞基本無明顯改變,三排外毛細(xì)胞中以內(nèi)兩排損害較重;地塞米松+慶大霉素(Dex+GM)組可見

16、外毛細(xì)胞的缺失程度明顯減輕,內(nèi)毛細(xì)胞基本無明顯改變。
　　 結(jié)論:地塞米松預(yù)處理對(duì)離體耳蝸Corti器的慶大霉素耳毒性具有拮抗作用。
　　 二、地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性作用的電生理學(xué)研究
　　 目的:探討地塞米松拮抗慶大霉素耳毒性的離子通道機(jī)制。
　　 方法:(1)豚鼠隨機(jī)分為6組,生理鹽水(control)組,生理鹽水0.5ml,ip;慶大霉素(GM)組,慶大霉素80mg/kg,im;地塞米松低濃度(

17、Dex-1)組,地塞米松0.2mg/kgip;地塞米松高濃度(Dex-h)組,地塞米松1mg/kgip;地塞米松低濃度+慶大霉素(Dex-1+GM)組,地塞米松0.2mg/kgip,慶大霉素80mg/kg,im;地塞米松高濃度+慶大霉素(Dex-h+GM)組,地塞米松1mg/kgip,慶大霉素80mg/kg,im。給藥前及給藥結(jié)束后,測(cè)定ABR反應(yīng)閾,計(jì)算ABR閾移。(2)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單離外毛細(xì)胞鈣敏感外向鉀電流。分別觀察0.1

18、、1、10、100、1000umol/L慶大霉素對(duì)鈣敏感外向鉀電流的影響;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單離外毛細(xì)胞鈣敏感外向鉀電流。分別觀察0.1、1、10、100、1000umol/L地塞米松對(duì)鈣敏感外向鉀電流的影響。
　　 結(jié)果:(1)生理鹽水(control)組、Dex-1組和Dex-h的ABR平均閾移很小,為1.0～1.6dB;GM組click平均閾移為10.6dB,短純音在5.0～21.0dB之間,并以6kHz及8kHz的閾移

19、最為明顯;Dex-1+GM組Dex-h+GM組click平均閾移為5.8～7.2dB,短純音在2.5～5.2dB之間,與GM組相比有顯著性差異(p＜0.05)。(2)慶大霉素以濃度依賴性方式抑制外毛細(xì)胞Ca2+敏感的外向K+電流;地塞米松以濃度依賴方式增大外毛細(xì)胞Ca2+敏感的外向K+電流。
　　 結(jié)論:地塞米松能夠顯著降低慶大霉素對(duì)豚鼠的耳毒性,并且對(duì)豚鼠聽功能沒有明顯影響;慶大霉素抑制外毛細(xì)胞Ca2+敏感的外向K+電流,可能