粘著斑激酶與涎腺腺樣囊性癌生物學(xué)行為關(guān)系的實驗研究.pdf

1、粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是Schaller[6]等1992年發(fā)現(xiàn)的含有SH2結(jié)構(gòu)域能使Src內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的一種非受體蛋白酪氨酸激酶。FAK結(jié)構(gòu)高度保守，人FAK基因編碼位于8q24，大致在c-myc的位點[1,2]。cDNA全長4285，編碼1028個氨基酸，分子量125KD。FAK處于傳導(dǎo)通路的樞紐，介導(dǎo)多條信號傳導(dǎo)通路，其與多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路如Src、PTKs、Shc、Grb2、PI

2、-3激酶存在聯(lián)系，這種網(wǎng)絡(luò)能激活細(xì)胞分裂蛋白如ERK蛋白，促使細(xì)胞分裂。 涎腺腺樣囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占全部涎腺腫瘤的9.95％，占涎腺惡性腫瘤的24％，平均為第二位的涎腺惡性腫瘤。SACC好發(fā)于小涎腺，絕大多數(shù)發(fā)生于頭頸部，身體其它部位極其少見。根據(jù)WHO分類分為3種亞型：腺樣(篩孔狀)型、管狀型和實質(zhì)型。三種表現(xiàn)型可在同一腫瘤體中存

3、在，類型的劃分主要是根據(jù)上述成分所占的比重。涎腺組織內(nèi)發(fā)生的SACC大體上似與周圍組織界限清楚，但剖面所見腫物無包膜，仔細(xì)審視可見其向周圍組織浸潤情況。少數(shù)病例亦有包膜，但常不完整。SACC是一種侵襲性很強的腫瘤，常見包膜內(nèi)、甚至包膜外都有癌細(xì)胞浸潤。鄰近腫瘤的組織如肌肉、骨及骨膜等，肉眼觀察近似正常組織而鏡檢常見癌細(xì)胞浸潤，因此很難確定腫瘤所累及的解剖范圍。SACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，甚至早期就發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要轉(zhuǎn)移部位是肺部。術(shù)后極易復(fù)

4、發(fā)，治療較困難，嚴(yán)重地危害患者的生命健康?？刂茝?fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床治療中的主要問題，而對SACC侵襲的研究是學(xué)者們關(guān)注的熱點。 FAK可以磷酸化很多在細(xì)胞分裂和分化中起關(guān)鍵作用的底物，在腫瘤發(fā)生方面起重要作用。本實驗應(yīng)用免疫組化技術(shù)，對FAK在SACC中的表達進行研究，探討FAK在SACC中的表達意義。為了探討FAK與SACC的關(guān)系，我們分別提取了SACC-LM及SACC-83兩種細(xì)胞系蛋白，對其中FAK的活性和蛋白表達進行了檢

5、測，從而在蛋白水平揭示FAK對SACC發(fā)生侵襲的影響。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)是近年來較受人們關(guān)注的促使細(xì)胞分裂的蛋白，它的異常表達與人類許多惡性腫瘤的進程有關(guān)，F(xiàn)AK是否與涎腺腺樣囊性癌的侵襲有關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗首次應(yīng)用酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein處理SACC-LM細(xì)胞，然后檢測SACC-LM細(xì)胞的的侵襲改變和ERK的mRNA表達，從而探

6、討粘著FAK對SACC侵襲的影響。 實驗方法：本研究收集了50例不同年齡及不同發(fā)生部位的SACC標(biāo)本及12例口腔正常涎腺新鮮標(biāo)本，采用免疫組化技術(shù)，對FAK和PTEN在SACC中的表達進行研究及與組織病理學(xué)分型的關(guān)系；同時，我們在進行SACC-LM及SACC-83兩種細(xì)胞系體外培養(yǎng)并細(xì)胞周期同步化的基礎(chǔ)上采用RT-PCR技術(shù)檢測SACC-LM及SACC-83兩種蛋白mRNA的表達；并采用Westernblotting法檢測SAC

7、C-LM及SACC-83細(xì)胞系FAK蛋白表達；測定FAK和ERK酶活力，從而在細(xì)胞蛋白水平揭示FAK與SACC的關(guān)系；下一步，為了探討FAK與SACC的侵襲的關(guān)系，我們應(yīng)用10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SACC-LM細(xì)胞系，同時對照組在同等條件下加入不同濃度的酪氨酸蛋白激酶阻斷劑Genistein處理細(xì)胞，作用不同時間，然后分別采用RT-PCR檢測FAK和ERK的mRNA表達；采用Westernblotting法檢測SACC-LM細(xì)胞

8、系FAK和ERK蛋白表達；MTF法測定細(xì)胞生長增殖情況及采用Transwell小室方法檢測細(xì)胞侵襲力。 實驗結(jié)果： 一.FAK在SACC標(biāo)本的表達1.FAK在SACC標(biāo)本的表達FAK在SACC標(biāo)本中定位在細(xì)胞漿。在正常涎腺腺細(xì)胞中無表達或低表達，而在導(dǎo)管細(xì)胞的胞漿中FAK都有表達。50例SACC標(biāo)本陽性47例，陰性3例；而12例正常腺體陽性2例，陰性10例。經(jīng)連續(xù)X2檢驗，有顯著性差異(P＜0.01)，F(xiàn)AK在SACC中

9、呈高表達。 2.FAK的表達與SACC標(biāo)本組織病理學(xué)分型的關(guān)系FAK在SACC標(biāo)本三種病理學(xué)分型，即腺樣型、小管型和實體型中的陽性表達率分別為86.96％、76.47％和80.00％。經(jīng)連續(xù)X2檢驗，三組間差異無顯著性(P＞0.05)，即FAK陽性表達與SACC組織病理學(xué)分型無關(guān)。 二.FAK在SACC-LM及SACC-83細(xì)胞中的活性及表達1.SACC-LM及SACC-83細(xì)胞中FAK活性及對比FAK在SACC-LM細(xì)

10、胞中的平均活性為18.320pmol/min/μg，F(xiàn)AK在SACC-83細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的平均活性為0.873pmol/min/μg，與SACC-83細(xì)胞相比，SACC-LM細(xì)胞中FAK具有較高的活性。 2.FAK在SACC-LM及SACC-83細(xì)胞中的表達及對比與SACC-83細(xì)胞相比，SACC-LM細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中FAK有較高表達。 三.FAK的變化對SACC-LM細(xì)胞侵襲能力的影響1.隨著抑制劑濃度的增高，F(xiàn)AK被抑制程

11、度的提高，ERK的表達減少，侵襲能力降低。 2.隨著抑制劑作用時間的延長，F(xiàn)AK被抑制程度的提高，ERK的表達減少，侵襲能力降低。 結(jié)論： 1.FAK蛋白在SACC中高表達，可能參與該腫瘤的生物學(xué)進程。 2FAK的表達與SACC的組織病理分型無關(guān)。 3.FAK蛋白活性變化與SACC的侵襲有關(guān)。 4.FAK蛋白表達變化與SACC的侵襲有關(guān)。 5.SACC肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞中，F(xiàn)AK的變化影響