人B7-2瘤苗與DC瘤苗的制備及其體外聯(lián)合誘導(dǎo)抗食管癌的免疫作用.pdf

1、授予單位代碼學(xué)號(hào)或申請?zhí)柮芗夃嵵荽髮W(xué)碩士學(xué)位論文論文題目作者姓名學(xué)科門類專業(yè)名稱導(dǎo)師姓名、職稱10459020819人B7—2瘤苗與DC瘤苗的制備及其體外聯(lián)合誘導(dǎo)抗食管癌的免疫作用路靜醫(yī)學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)董子明教授二零零五年五月十六日鄭州犬學(xué)2005屆碩士學(xué)位論文人B72瘤苗與DC瘸苗的制備放其體外聯(lián)臺(tái)誘導(dǎo)抗食管癌的免疫作用應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR、巢式PCR的方法從重癥胍無力患者胸腺組織中擴(kuò)增B7—2cDNA基因片段，經(jīng)同收、純化、酶切鑒定

2、后，依次連接到質(zhì)粒pOEM—T和pEGFPN3上。2人B72瘤苗的制各應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pEGFPN3。B72轉(zhuǎn)染EC9706，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合基因的表達(dá)情況。G418加壓篩選30d，獲得穩(wěn)定表達(dá)融合基因的EC9706細(xì)胞，RTPCR檢測B72基因的表達(dá)。3人DC瘤苗的制備31采用反復(fù)凍融法制備人食管癌細(xì)胞EC9706抗原32臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的分離及DC、T細(xì)胞的誘導(dǎo)采用密度梯度離心法從臍血中分離M

3、NC后，加入含15％自體血漿的RPMll640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞接種入24孑L板，37。C5％C02孵箱培養(yǎng)2h后，輕輕吸出上清置培養(yǎng)瓶中獲得T淋巴細(xì)胞，加入因子rhlL2(Sng／m1)繼續(xù)培養(yǎng)。24孔板中貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rhGMCSF(10ng／m1)、rhIL4(10ng／m1)誘導(dǎo)分化，第3d加入EC9706的凍融抗原，第6d加入LPS(5pg／m1)，第7d收獲負(fù)載腫瘤抗原的成熟樹突狀細(xì)胞。33DC激活自體T淋巴細(xì)

4、施為CTL取腫瘤相關(guān)抗原(TAA)致敏的成熟DC與T淋巴細(xì)胞以1：20比例混合，共培養(yǎng)3d。DC遞呈抗原并激活幼稚T淋巴細(xì)胞，促使T淋巴細(xì)胞活化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。4MTT法檢測B72瘤苗與DC瘤苗體外聯(lián)合抗食管癌細(xì)胞效應(yīng)致敏的T細(xì)胞(CTL)為效應(yīng)細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFPN3的EC9706、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFPN3B7—2的EC9706、未轉(zhuǎn)染的EC9706為靶細(xì)胞，效靶比為30：1，分組進(jìn)行混合培養(yǎng)72h，MTT法檢測T淋