DEN誘發(fā)大鼠肝癌形成過程中差異表達蛋白質(zhì)組分析及AKR1B10的研究.pdf

1、本研究用二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌形成，以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)染色陽性的肝細胞增生灶(γ-GT陽性灶)為標志獲取肝癌前病變的組織標本，再用比較蛋白質(zhì)組學技術對大鼠肝癌組織、肝癌前病變組織和正常肝組織的全蛋白質(zhì)組表達譜進行差異分析，篩選出一批差異表達蛋白。隨后，本研究對部分篩選出來的差異表達蛋白質(zhì)如醛糖還原酶1B10(AKR1B10)、波形蛋白(VIMENTIN)進行表達水平改變的驗證，再應用RNA干擾(RNA)技術對AK

2、R1B10進行腫瘤相關生物學功能分析和機制探討，以及應用組織芯片和免疫組化技術觀察和分析AKR1B10在較大樣本量的人肝癌組織中的表達及其臨床意義。研究結(jié)果表明，AKR1B10在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關基因的表達來影響細胞的增殖和凋亡能力，它在肝癌組織中的表達與肝癌組織的分化程度相關，在血清甲胎蛋白(α-fetal protein，AFP)陰性患者的肝癌組織中高表達。這些結(jié)果提示AKR1B10對預測肝癌的發(fā)生和預后可能有

3、一定的價值，是一種具有潛在應用前景的肝癌早期診斷的分子標志物。本研究分為四個部分： 第一部分，DEN誘發(fā)大鼠肝癌發(fā)生過程中差異表達蛋白質(zhì)組學研究。建立DEN誘發(fā)大鼠肝癌實驗模型，應用比較蛋白質(zhì)組學技術觀察大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展不同階段的肝組織中蛋白質(zhì)表達譜的改變，從中篩選出在肝癌發(fā)生過程中起重要作用的候選蛋白。結(jié)果顯示實驗組共有9只動物發(fā)生肝癌，肝癌發(fā)生的最早時間為實驗第21周；對照組無1例發(fā)生肝癌。γ-GT組織化學染色顯示隨著DEN

4、誘癌時間延長，γ-GT陽性灶數(shù)量增多、面積增大，癌前組織中γ-GT陽性灶總面積與肝組織切片面積比達29％～43％；肝癌組織γ-GT染色全為陽性；正常肝組織內(nèi)無γ-GT陽性灶。應用2-DE技術篩選出組間表達水平差異≥2倍或特異存在的蛋白點127個，質(zhì)譜鑒定出AKR1B10、VIMENTIN和粘連蛋白受體1(laminin receptor1，LAMR1)等82種蛋白質(zhì)，其中肝癌組織與正常組織相比有75個差異表達蛋白質(zhì)，肝癌組織與癌前組織相

5、比有39個差異表達蛋白質(zhì)，癌前組織與正常組織相比有14個差異表達蛋白質(zhì)，在以上三種比較中同時差異表達的蛋白質(zhì)有5個。生物信息學分析顯示，這些差異表達蛋白質(zhì)主要位于細胞質(zhì)和線粒體；發(fā)揮酶的活性作用、氧化還原和結(jié)合等功能；參與的主要生物學過程為代謝、運輸和轉(zhuǎn)移、生物合成和氧化應激等。應用IntACT數(shù)據(jù)庫分析差異表達蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)現(xiàn)4型葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)是相互作用網(wǎng)絡中的一個共同節(jié)點。 第二部分，差異表達蛋白AKR1

6、B10和VIMENITN在大鼠和人肝癌組織中的表達驗證。研究方法主要為應用Western blot和RT-PCR方法分別檢測AKR1B10和VIMENTIN在大鼠和人肝癌組織中的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的表達情況，以及應用免疫組化染色觀察AKR1B10在肝細胞中的定位。結(jié)果顯示：①AKR1B10蛋白定位于肝細胞胞漿內(nèi)，其蛋白表達水平和mRNA表達水平在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中依次上調(diào)；AKR1B10蛋白表達水平在人正常肝、癌旁

7、肝及肝癌組織中也依次上調(diào)。②VIMENTIN蛋白在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中表達依次明顯上調(diào)；VIMENTINmRNA在大鼠肝癌組織中明顯升高，在肝癌前病變組織中輕度升高但與正常肝組織間的差別無統(tǒng)計學意義；VIMENTIN蛋白在人正常肝、癌旁肝及肝癌組織中的表達依次上調(diào)。結(jié)果顯示的AKR1B10和VIMENTIN的表達變化趨勢與2-DE結(jié)果基本一致，提示本研究采用的2-DE和MALDI-TOF-MS/MS蛋白質(zhì)組學技術平臺具有相

8、當?shù)姆€(wěn)定性和可靠性。在mRNA和蛋白質(zhì)兩個水平上，AKR1B10和VIMENTIN不僅在大鼠正常肝、肝癌前病變、肝癌組織中表達依次上調(diào)，并且在人正常肝、肝癌旁組織、肝癌組織中的表達水平也顯著依次升高，提示這兩個蛋白可能參與人類肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。 第三部分，AKR1B10在肝癌發(fā)生過程中作用及機制的初步探討。應用RNAi技術和腫瘤相關生物學功能鑒定方法，觀察AKR1B10表達被抑制后對人肝癌細胞系MHCC97H相關功能的影響，并

9、探討其機制。應用RT-PCR、Western blot檢測AKP1B10 mRNA和蛋白在肝癌細胞系MHCC97L、MHCC97H、SMMC-7721和BEL-7402及正常肝細胞系Changliver中的表達以篩選AKR1B10表達量最高的細胞系，然后采用RNAi技術，將化學合成的兩對針對AKR1B10的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)瞬時轉(zhuǎn)染至肝癌細胞MHCC97H細胞，再通過實時熒光定量PCR(

10、real-time PCR)、細胞免疫熒光、Western blot及AKR1B10酶活性檢測，篩選干擾效果最明顯的一對siRNA作RNAi組，另設置陰性對照組(Mock，轉(zhuǎn)染無效用的dsRNA)和空白對照組(Con，不作任何轉(zhuǎn)染)，最后觀察AKR1B10表達下調(diào)后對MHCC97H細胞的增殖、凋亡、粘附、運動等腫瘤相關生物學功能的影響，并用Real-time PCR檢測干擾AKR1B10表達后c-myc等腫瘤相關基因的表達變化。結(jié)果顯示

11、，AKR1B10在所檢測的四種肝癌細胞系中均有不同程度的表達，以在MHCC97H細胞中表達最強；在正常肝細胞Changliver中無表達。瞬時轉(zhuǎn)染AKR1B10-siRNA48h和72h后，MHCC97H細胞中的AKR1B10mRNA和蛋白表達受到較為明顯的抑制。CCK-8實驗結(jié)果顯示AKR1B10表達被干擾后MHCC97H細胞生長受到抑制，抑制率在24h、48h、72h和96h分別為6.5％、18.0％、26.6％和22.7％。流式細

12、胞儀檢測結(jié)果顯示RNAi組的凋亡細胞比例顯著高于與陰性和空白對照組，三組分別為37.30％、5.18％和5.57％(p＜0.05)。粘附實驗結(jié)果顯示RNAi組在30min、50min和70min時的粘附細胞數(shù)與陰性對照組和空白組均無明顯差異。體外運動實驗結(jié)果顯示RNAi組、陰性對照組和空白對照組中MHCC97H細胞穿過微孔濾膜到達下室面的細胞數(shù)分別為21±4、20±3和18±2個，三組間的差別無統(tǒng)計學顯著性。Real-time PCR檢

13、測發(fā)現(xiàn)干擾AKR1B10表達后，RNAi組中癌基因c-myc、c-fos、N-ras和增殖相關基因ki-67表達下降，促凋亡基因casps-3和bax表達上調(diào)。 第四部分。AKR1B10在較大樣本人肝癌組織中的表達及臨床意義的研究本部分利用組織芯片和免疫組化技術檢測AKR1B10蛋白在65例人肝癌及其相應癌旁組織、14例正常人肝組織中的表達情況，分析肝癌組織中AKR1B10蛋白表達與患者的臨床病理特征的關系，評估AKR1B10作

14、為新的肝癌早期診斷分子標志物的可能性。結(jié)果顯示AKR1B10蛋白在人正常肝組織、癌旁肝組織及肝癌組織中的表達率和表達量均依次升高，并且差別具有統(tǒng)計學顯著性(p<0.05)。AKR1B10在肝癌組織的表達水平與該組織的Edmondson病理分級相關，即其表達量在分化程度為I～II級的肝癌組織中顯著高于III～IV級(p<0.05)。65例肝癌組織中AKR1B10陽性表達率為76.92％，明顯高于本組患者術前血清AFP陽性率(55.38％，

15、p<0.05)。在28例術前血清AFP陰性的肝癌組織中，21例(75.0％)顯示為AKR1B10表達陽性。卡方檢驗顯示AKR1B10在肝癌患者組織中的表達與術前血清AFP無相關性(p>0.05)。 研究表明：⑴應用γ-GT組織化學染色和HE染色相結(jié)合的辦法有助于識別和準確獲取大鼠肝癌前病變組織用于比較蛋白質(zhì)組學研究，從而實現(xiàn)動態(tài)觀察肝癌形成過程中差異表達蛋白。⑵本研究通過2-DE和質(zhì)譜技術篩查出的一系列與肝癌相關的差異表達蛋白質(zhì)