中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后谷氨酸的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的機(jī)理研究.pdf

1、背景:L-谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)，主要位于大腦皮層和海馬等部位。當(dāng)谷氨酸病理性升高時(shí)，其作為一種神經(jīng)毒素可以誘導(dǎo)嚴(yán)重的神經(jīng)元損傷，谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度激活或谷氨酸的過(guò)度刺激都將引起細(xì)胞的死亡，這種病理過(guò)程被稱為谷氨酸的神經(jīng)毒性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性伴隨著線粒體膜電位的下降以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的過(guò)度生成，這些線粒體功能障礙指標(biāo)提示谷氨酸的神經(jīng)毒性與線粒體功能可能存在聯(lián)系。
　　線粒體是一種高度動(dòng)態(tài)

2、的細(xì)胞器，通過(guò)不斷的分裂融合保持線粒體動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)。最近研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)會(huì)影響到線粒體正常的功能，趨向于分裂導(dǎo)致線粒體碎片產(chǎn)生，線粒體縮短;相反趨向于融合時(shí)導(dǎo)致線粒體變長(zhǎng)。線粒體的融合/分裂運(yùn)動(dòng)主要被一系列線粒體融合/分裂蛋白調(diào)控。這些蛋白主要包括了:分裂蛋白:.dynamin-like protein1（DLP1，也叫Drp1），以及它的作用因子包括Fis1，Mff, MiD49 and MiD51;融合蛋白:Mitofusi

3、n1(Mfn1)，Mitofusin2(Mfn2)以及optic atrophy protein1(OPA1)。這些蛋白除了調(diào)控線粒體的形態(tài)，也在線粒體功能正常運(yùn)行的各個(gè)環(huán)節(jié)上有重要的作用。因而順理成章，目前已有很多研究表明線粒體的分裂/融合穩(wěn)態(tài)的改變可以導(dǎo)致線粒體的功能障礙，引起相關(guān)神經(jīng)疾病。
　　目的:通過(guò)對(duì)大鼠原代神經(jīng)細(xì)胞，谷氨酸灌注小鼠模型，轉(zhuǎn)基因小鼠，人體標(biāo)本的研究，探索谷氨酸的神經(jīng)毒性信號(hào)通路，然后找到并證實(shí)介導(dǎo)谷氨酸

4、神經(jīng)毒性的關(guān)鍵蛋白，最終在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外，動(dòng)物模型以及人體上闡明并證明谷氨酸的神經(jīng)毒性機(jī)理以及信號(hào)通路。
　　方法和材料:抗體、質(zhì)粒、化學(xué)試劑及測(cè)量方法
　　購(gòu)買或獲得質(zhì)粒:MitoDsRed2(Clontech公司，Mountain View, CA)，Case12construct(來(lái)自Evrogen公司，Moscow, Russia)，GFP-Cre(來(lái)自Addgene公司，Cambridge MA)以及GFP/Myc

5、-tagged Mfn2（斯坦福大學(xué)提供）.通過(guò)neomycin/kanamycin抑制基因在MitoDsRed2序列中利用核定位信號(hào)(GFP-Cre質(zhì)粒中的NLS-Cre)增加Cre序列成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動(dòng)子質(zhì)粒.克隆mitoDsRed2并導(dǎo)入pLVX-Puro(Clontech公司，Mountain View, CA)質(zhì)粒用NLS-Cre替代puromycin抑制基因成功構(gòu)建MitoDsRed2/Cre雙啟動(dòng)子

6、慢病毒。利用第三代慢病毒包裝盒(包裝系統(tǒng):pMDLg/pRRE和pRSV-Rev;包裹質(zhì)粒:Addgene公司，Cambridge MA的pMD2.G)成功制備慢病毒。得到數(shù)據(jù)后，裂解細(xì)胞并測(cè)定細(xì)胞總蛋白，氧消耗量根據(jù)總蛋白不同進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化量化。通過(guò)Cytotoxicity Detection試劑盒(LDH; Roche公司，Nutley,NJ)或CellProliferation試劑盒(MTT法;Roche公司，Nutley,NJ)測(cè)定

7、細(xì)胞死亡和生存率。通過(guò)細(xì)胞普羅匹定碘化物測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞存活率。帶有普羅匹定碘化物陽(yáng)性細(xì)胞核或者可見(jiàn)的細(xì)胞核碎片或神經(jīng)突碎片的神經(jīng)細(xì)胞計(jì)作壞死神經(jīng)細(xì)胞，而普羅匹定碘化物陰性的細(xì)胞核并且具有完整的神經(jīng)細(xì)胞核輪廓或者神經(jīng)突的神經(jīng)元計(jì)為存貨細(xì)胞。
　　原代神經(jīng)細(xì)胞的分離
　　原代神經(jīng)細(xì)胞分離（應(yīng)用大鼠腦組織或胚胎或）利用鼠Thy-1.2基因表達(dá)盒將Thy1-Mfn2注射入C57BL/6N鼠受精卵內(nèi)成功構(gòu)建mfn2過(guò)表達(dá)小鼠。根據(jù)美國(guó)動(dòng)

8、物保健和使用委員會(huì)(IACUC)制定的指南處理適宜懷孕時(shí)間的Sprague-Dawley母鼠（大鼠）(Harlan or Charles River)或者C57BL/6N母鼠（小鼠），成功從E13-15母鼠（大鼠）/E12-14母鼠（小鼠）胚胎中分離原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，從E18母鼠（大鼠）胚胎中分離原代神經(jīng)細(xì)胞。
　　線粒體的純化及蛋白質(zhì)印記分析
　　在細(xì)胞中加入1xLysis buffer(Cell Signaling公司，

9、Danvers，MA)和1 mMPMSF(Sigma公司，St.Louis，MO)以及蛋白酶抑制劑(Sigma公司，St.Louis，MO)提取總蛋白.用SDS-PAGE溶解同樣體積的總蛋白然后轉(zhuǎn)到Immobilon-P(Millipore公司，Billerica, MA)膜.10％的脫脂牛奶封閉后,用一抗二抗進(jìn)行孵育，蛋白膜用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millip

10、ore公司，Billerica，MA)顯影劑進(jìn)行顯影曝光.
　　谷氨酸灌注小鼠動(dòng)物模型的建立
　　所有小鼠的手術(shù)及手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格按照美國(guó)NIH指南進(jìn)行，并且依據(jù)動(dòng)物護(hù)理及使用協(xié)會(huì)IACUC的規(guī)定進(jìn)行操作。迷你滲透性泵(2001模型，Alzet公司，Cupertino，CA;液體泵速率1μl/小時(shí))接入2cm的大腦注入管(腦注入盒，Alzet公司，Cupertino，CA)并在其中分別泵入模擬腦脊液aCSF(成分:124 mM

11、NaCl，25 mMNaHCO3,10 mM D-glucose,2.5 mM KCl,1 mM MgCl2,2 mM CaCl2和1mMNaH2PO4，并用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4)或者aCSF溶解10mM谷氨酸。并依據(jù)使用說(shuō)明在37度環(huán)境下通宵注射藥物。
　　小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)成功構(gòu)建免疫熒光小鼠，以便于利用線粒體特征蛋白Tom20和VDAC1更好的觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)。簡(jiǎn)要介紹過(guò)程

12、如下:用蒸餾水沖洗3次組織切片放置于1x抗原decloaker(Biocare公司，Concord，CA)試劑中。在22psi氣壓下加熱至125度10秒，然后在0 psi氣壓下冷卻至90度30秒，利用Biocare公司的Decloaking Chamber高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)。隨后用10％的羊血清(NGS，St.Louis，MO)對(duì)切片封閉30分鐘，并在1％羊血清的PBS中孵育一抗過(guò)夜。第二天PBS沖洗3次后用10％的羊血清孵育10分鐘，

13、然后加入熒光顯影二抗(Invitrogen公司，Grand Island，NY)(1∶300)室溫避光孵育2小時(shí)，最后切片用PBS清洗，用DAPI染色，再次用PBS洗3次，加入熒光介質(zhì)油(Southern Biotech公司，Birmingham，AL)。
　　小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的電鏡檢測(cè)
　　EM固定液(the quarter strength Karnovsky-1.25％ DMSO mixture)通過(guò)心臟灌注法輸入小鼠

14、體內(nèi)5分鐘后迅速取出脊髓并放置于EM固定液中室溫15分鐘，更換新鮮EM固定液繼續(xù)固定2小時(shí)。PBS清洗后組織塊用1％ osmium-1.25％ferrocyanide mixture室溫固定2小時(shí)。組織切片清洗后浸泡在酸化的0.5％uranylacetate溶液中.再次沖洗后組織塊在濃度依次上升的酒精中脫水，最后包裹在Poly/Bed812樹(shù)脂中(Polysciences公司，Warrington，PA).較薄的切片隨后用2％酸化ura

15、nyl acetate染色并用Gatan single tilt，Gatan US40004kx4k CCD電鏡觀察(Gatan公司，Pleasanton, CA)。
　　體外鈣蛋白酶切割實(shí)驗(yàn)
　　100ug純化線粒體蛋白以及1ug重組Mfn2蛋白(Origene公司，Rockville，MD)分別與人紅細(xì)胞純化u-calpain(calpain-1)(Biovision公司，Milpitas，CA)蛋白在30度孵育30分鐘

16、。以calpain-Ⅰ提前與PMSF或者calpeptin30度孵育5分鐘為抑制組。最后添加含有62.5 mM Tris-HCl，4％ SDS，10％ glycerol，50 mM DTT和0.1％ bromophenol blue(pH6.8)的SDS樣本液停止反應(yīng).樣本經(jīng)過(guò)100度10分鐘變性煮沸，加入1/6的反應(yīng)蛋白量進(jìn)行免疫印跡分析。
　　結(jié)果:1.在神經(jīng)細(xì)胞中谷氨酸可導(dǎo)致線粒體破裂
　　2.在神經(jīng)細(xì)胞中，Mfn2的

17、缺失可導(dǎo)致線粒體和神經(jīng)細(xì)胞的毒性
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):Mfn2過(guò)表達(dá)可以阻斷谷氨酸介導(dǎo)的線粒體功能障礙和神經(jīng)細(xì)胞死亡
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):Mfn2過(guò)表達(dá)可以保護(hù)線粒體和神經(jīng)細(xì)胞免于谷氨酸所引起的細(xì)胞毒性
　　5.谷氨酸作用于神經(jīng)細(xì)胞后通過(guò)激活Calpain來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)mfn2的剪切
　　6.在人體標(biāo)本中驗(yàn)證了谷氨酸所介導(dǎo)的calpain的激活，mfn2的剪切，以及線粒體的破裂
　　結(jié)論:谷氨酸介導(dǎo)calpain的激

18、活剪切mfn2后，可引起線粒體功能障礙及運(yùn)動(dòng)障礙，最終出現(xiàn)谷氨酸的神經(jīng)毒性并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。通過(guò)阻斷mfn2的剪切可以在細(xì)胞模型及動(dòng)物模型上阻斷谷氨酸所介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。創(chuàng)新性及意義:谷氨酸的神經(jīng)毒性作用廣泛存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中包括腦出血，卒中，腦腫瘤，中樞系統(tǒng)感染，并且與相關(guān)疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)到體外，從細(xì)胞模型到動(dòng)物模型再到人體模型均證實(shí)了谷氨酸所介導(dǎo)的mfn2剪切所導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，意義重大，相關(guān)信號(hào)通路將可能成為未