道地藥材研究模型“丹參毛狀根”的評價研究.pdf

1、作為中醫(yī)藥的精髓，藥材的道地性既有來源于歷史和文化的屬性，又涉及到遺傳、環(huán)境及生產(chǎn)實踐等方方面面。從生物學(xué)上說“道地藥材”的形成是基因型與環(huán)境之間相互作用的產(chǎn)物，可用公式表示：表型=基因型+環(huán)境飾變。道地藥材是一個復(fù)雜系統(tǒng)，它的每一個因素及其相互作用不可能都被同時考察，研究中必須有所取舍，對研究對象降階降維，才有可能取得突破。環(huán)境因子究竟是如何通過修飾道地藥材的基因型而發(fā)生作用的，生態(tài)因子與道地藥材次生代謝產(chǎn)物積累的有著怎樣的關(guān)系，至今

2、缺少直接和系統(tǒng)的實驗研究。至此，科學(xué)模型因其具有簡化復(fù)雜研究對象的特點，開始引起道地藥材研究者的關(guān)注，構(gòu)建道地藥材研究模型（載體），成為道地藥材生物學(xué)研究的關(guān)鍵。
　　 模型在生物學(xué)中的應(yīng)用相當廣泛。通過在基本原型的基礎(chǔ)上建立相關(guān)的模型，并運用相應(yīng)的模型分析解釋生物學(xué)現(xiàn)象、揭示生物本質(zhì)規(guī)律特征，研究某種動態(tài)生命系統(tǒng)中各種因子之間相互關(guān)系。作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究不可缺少的重要手段，模型和模型方法很早就已經(jīng)滲透到生命科學(xué)研究的各個環(huán)節(jié)

3、，例如用于基因工程研究的模式物種，用于醫(yī)學(xué)實驗的動物模型等。
　　 毛狀根培養(yǎng)是80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結(jié)合的一項新技術(shù)，它是將發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒中含有的T-DNA轉(zhuǎn)化到植物細胞的DNA上，誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生毛狀根。毛狀根作為一種有效的長期保持物種優(yōu)良性狀的方式，越來越多的被人們作為實驗材料，同時獲取次生代謝產(chǎn)物。毛狀根具有生長速度快，且不受氣候、病蟲害、地理和季節(jié)的限制等特點。據(jù)不完全統(tǒng)計，國內(nèi)外目前己對29科5

4、2種藥用植物進行了毛狀根誘導(dǎo)的研究，建立了長期的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，獲得次生代謝產(chǎn)物。
　　 本論文針對目前道地藥材生物學(xué)本質(zhì)研究中需要解決的問題，在本實驗室開展工作的基礎(chǔ)上，選取丹參毛狀根作為研究對象，對其是否具備道地藥材研究模型的特性進行了系統(tǒng)的評價研究。即毛狀根到底能不能作為模型來研究道地藥材?能不能再現(xiàn)原植物藥材的特性，是否能作為穩(wěn)定的可重復(fù)的研究工具等。
　　 該模型的評價研究，涉及到植物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等

5、許多層面。主要包括三個方面：①再現(xiàn)性，作為研究道地藥材的模型要考察毛狀根和其原型（即原藥材）之間的相似性，包括化學(xué)成分，毒性以及藥效等，來闡明毛狀根是否具有再現(xiàn)原藥材的特性。②穩(wěn)定性，毛狀根的核DNA的穩(wěn)定性、rol基因遺傳穩(wěn)定性、化學(xué)成分穩(wěn)定性等。③實用性，在證明毛狀根模型具有穩(wěn)定性和再現(xiàn)性的基礎(chǔ)上，對其作為模型的實用性進行了研究，考察毛狀根是否便于取材，是否具備優(yōu)良的實驗物性，作為模型是否易于建立和使用。
　　 1.丹參毛狀

6、根模型的再現(xiàn)性研究（與原植物的相似性）
　　 1.1化學(xué)成分的相似性選取藥典中的指標成分丹參酮ⅡA和丹酚酸B，對丹參毛狀根和河北丹參藥材進行了含量測定，丹參藥材中丹參酮ⅡA含量為0.12％，丹酚酸B含量為5.4％；各個批次的毛狀根丹參酮ⅡA的含量在0.04％～0.10％之間，平均值與藥材相比較低；丹酚酸B的含量在3.21％～7.25％，平均值與藥材相比較高。同時，用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版軟件進行相似度分析，對

7、毛狀根與藥材的指紋圖譜也進行了比較，相似度在0.948以上，說明丹參毛狀根的化學(xué)成分組成與2個產(chǎn)地（河北靈壽，四川中江）的丹參藥材相比差異不顯著。由此可見，丹參毛狀根與丹參藥材具有相似的化學(xué)成分。
　　 1.2急性毒性丹參毛狀根提取物L(fēng)D50為63.94g生藥/kg，95％可信區(qū)間為（58.82～69.51）g生藥/kg。按公斤體重計算相當于成人日攝入量（丹參臨床人用劑量為9～15ed日，0.25g生藥/kg）的255.76倍。

8、結(jié)果表明，丹參毛狀根最大無毒劑量已超過人臨床用藥量的100倍。
　　 1.3藥效的相似性丹參根為傳統(tǒng)的“活血化瘀”中藥。其各種制劑應(yīng)用于冠心病與心血管病治療收到了良好的效果。本實驗從整體、器官以及細胞三個水平上觀察丹參毛狀根對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。①整體實驗表明，丹參毛狀根組能顯著降低缺血再灌注所致VT，VF的發(fā)生率，降低血漿LDH，MDA含量，提高SOD活性；與丹參藥材相比無顯著性差異。②離體實驗發(fā)現(xiàn)，丹參毛狀根能夠增

9、加冠脈流量，不但降低心律失常的發(fā)生率，而且推遲心律失常的發(fā)生時間，縮短持續(xù)時間和恢復(fù)時間，對LDH，MDA和SOD的釋放有明顯的改善作用，結(jié)果提示丹參毛狀根處理對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷可能具有保護作用；與丹參藥材相比無顯著性差異。⑨細胞實驗表明，丹參毛狀根可較顯著增加H/R心肌細胞的存活率，降低MDA含量，提高SOD活性。各組隨劑量增大LDH，MDA含量減少，SOD活性增加，丹參毛狀根可拮抗大鼠心肌細胞H/R損傷，對大鼠心肌細胞H/

10、R損傷可能具有保護作用；與丹參藥材相比無顯著性差異。上述研究表明，丹參毛狀根與丹參藥材對心肌缺血再灌注損傷的保護作用相當。
　　 2.丹參毛狀根模型的穩(wěn)定性研究2.1核DNA的穩(wěn)定性通過流式細胞儀對丹參毛狀根核DNA濃度的分析，選取大豆作為內(nèi)參物，結(jié)果表明所選取的5批丹參毛狀根樣品，核DNA含量平均為0.18pg/2C，基因組大小平均為87.8Mbp，RSD為6.6％，核DNA的濃度比較穩(wěn)定。2.2rol基因的穩(wěn)定性從隨機培養(yǎng)的

11、丹參毛狀根中任選10批，提取新鮮組織的DNA，并進行PCR擴增，結(jié)果表明，外源基因rolA在10批樣品的基因組DNA中均可以檢測到，并將rolA基因作為目的基因進行了回收測序與GeneBank登錄序列（X12579）的同源性為100％。由此可以說明10個批次的丹參毛狀根樣品中rol基因是穩(wěn)定的。
　　 2.3化學(xué)成分的穩(wěn)定性通過對丹參毛狀根的指紋圖譜研究，對其化學(xué)成分的穩(wěn)定性進行了分析。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004

12、A版軟件進行相似度分析，從計算結(jié)果可以看出，10批毛狀根的相似度均在0.970以上，說明不同批次丹參毛狀根樣品間化學(xué)成分組成的差異不顯著。同時，通過對不同批次的丹參毛狀根的生長情況的分析表明，不同批次生長率無顯著性差異，比較穩(wěn)定。
　　 3.丹參毛狀根模型的實用性研究3.1丹參毛狀根的生長周期研究6，7-V培養(yǎng)基上培養(yǎng)丹參毛狀根，分別在第2，4，6，8，10周收獲，測定其生長量。高效液相色譜法測定丹參毛狀根中丹參酮ⅡA和丹酚酸B

13、的含量。在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根，收獲時應(yīng)選擇6周比較合適，此時毛狀根的增長倍數(shù)大，有效成分相對來說也比較高。由此可見，丹參毛狀根培養(yǎng)周期短，6～8周即可收獲，具有快速繁殖的特性，并能迅速積累次生代謝產(chǎn)物。
　　 3.2礦質(zhì)營養(yǎng)元素對丹參毛狀根生長和有效成分積累的影響本實驗通過在6，7-V培養(yǎng)基的礦質(zhì)營養(yǎng)元素配方基礎(chǔ)上進行加減，深入研究了培養(yǎng)基中氮、鉀、鐵、鎂4種單一礦質(zhì)營養(yǎng)元素的濃度，對丹參毛狀根生長和有效成分積累的影響。結(jié)

14、果表明，氮元素對毛狀根的生長影響最大，其次是鉀元素。鐵元素和鎂元素對丹參毛狀根的生長量影響不大。從有效成分含量的積累來看，低氮以及完全處理組的鐵和鎂元素有利于丹參酮ⅡA的累積。高氮，高鉀有利于丹酚酸B的積累。培養(yǎng)基中這4種元素濃度的改變都會對毛狀根產(chǎn)生不同程度的刺激，進而影響其生長和有效成分的積累，由此證明丹參毛狀根對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的刺激具有靈敏性，因此，可以用毛狀根作為模型進行更深一步的道地產(chǎn)區(qū)環(huán)境因子變化的分析研究。
　　 結(jié)

15、論
　　 本論文的研究結(jié)果表明：丹參毛狀根具有良好的再現(xiàn)原藥材的特性，可以替代原藥材作為研究模型，各個批次遺傳、化學(xué)比較穩(wěn)定，取材方便，生長繁殖快，具有優(yōu)良的實驗物性，作為模型具有一定的實用性。
　　 通過對丹參毛狀根的評價研究，認為毛狀根可以作為研究模型。用毛狀根為模型，可以以道地藥材表型與生境及基因型的相互關(guān)系為切入點，深入研究道地藥材對環(huán)境的響應(yīng)，基因的功能、表達的調(diào)控機制等。
　　 本論文首次提出道地藥材