膜聯(lián)蛋白A7與人子宮頸鱗癌的關(guān)系及機(jī)理研究.pdf

1、在全球范圍內(nèi)每年約有20多萬(wàn)女性死于宮頸癌，在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌尤為常見(jiàn)，成為婦科三大惡性腫瘤之一。其中宮頸鱗癌占宮頸癌的90％以上，其發(fā)病率和致死率均居高不下。但是，到目前為止，宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及形成過(guò)程，我們的研究了解還很局限。目前發(fā)現(xiàn)子宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和惡變的過(guò)程主要包括基因水平，蛋白水平，組織水平等多方面，多因素的變化，各種條件的協(xié)同作用導(dǎo)致了腫瘤形成。
　　 膜聯(lián)蛋白(Annexin)超家族共包括A、B、C、D、

2、E五個(gè)家族，其中在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的Annexin為A家族。它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上的高度相似性，功能上也有相似之處，比如它們都參與了細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)活動(dòng)、細(xì)胞的胞飲和胞吐、細(xì)胞膜受體構(gòu)象和功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜離子通道的調(diào)控等重要功能。很多國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白家族中的成員在某些腫瘤組織中表達(dá)與正常組織出現(xiàn)不同。人類(lèi)AnnexinA7基因位于染色體10q21，有14個(gè)外顯子，編碼兩種亞型，它們的分子量分別為47kD和51kD的。在心臟和腦中，兩種亞型

3、同時(shí)表達(dá)，而在其他組織中只有47kD的亞型表達(dá)。迄今為止對(duì)AnnexinA7的功能研究沒(méi)有確鑿的定論，各個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)道不盡一致，對(duì)它的研究大部分還都僅僅停留在推測(cè)和假說(shuō)的階段。
　　 本實(shí)驗(yàn)分別收集人宮頸鱗癌和正常組織，研究?jī)烧逜nnexin A7的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Annexin A7在人宮頸鱗癌表達(dá)上調(diào)，提示其在人宮頸鱗癌發(fā)生過(guò)程中起著十分重要的作用。為了進(jìn)一步研究Annexin A7發(fā)揮作用的機(jī)理我們首先培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系He

4、La細(xì)胞，鑒定HeLa細(xì)胞中有AnnexinA7的表達(dá)后，通過(guò)siRNA干擾技術(shù)，降低Annexin A7在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平，觀察和檢測(cè)HeLa細(xì)胞在增殖與凋亡方面的變化。初步確定AnnexinA7對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡具有抑制作用后，我們?cè)俅螒?yīng)用siRNA干擾技術(shù)降低Annexin A7在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)水平，然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和Western blot觀察Bax、Bcl-2、Fas、Fasl和Apaf-1蛋白的表達(dá)變化

5、，初步探討Annexin A7對(duì)凋亡的影響及可能通過(guò)的凋亡途徑，為進(jìn)一步研究人子宮頸鱗癌的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分、膜聯(lián)蛋白A7在人子宮頸鱗癌和正常組織中的表達(dá)研究
　　 目的：研究膜聯(lián)蛋白A7(Annexin A7)在人子宮頸鱗癌和正常組織中的表達(dá)情況。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本采集：于河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院和河北省人民醫(yī)院收集新鮮宮頸鱗癌組織25例及正常宮頸組織25例，于液氮中保存。于

6、河北省人民醫(yī)院病理科獲得人宮頸鱗癌蠟塊25例，正常宮頸蠟塊25例，置于4℃冰箱保存。
　　 2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)-SP法在組織水平檢測(cè)人宮頸鱗癌和正常組織中膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)的情況。
　　 3.應(yīng)用Western blot法在蛋白水平檢測(cè)人宮頸鱗癌和正常組織中膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)的情況。
　　 4.應(yīng)用半定量RT-PCR法在mRNA水平檢測(cè)人宮頸鱗癌和正常組織中膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)的情況。
　　 1.免疫組化

7、：在組織水平，膜聯(lián)蛋白A7在宮頸鱗癌組織的表達(dá)高于正常宮頸組織(P＜0.05)。
　　 2.Western blot:膜聯(lián)蛋白A7在蛋白水平的表達(dá)情況為宮頸鱗癌組織表達(dá)高于正常宮頸組織(P＜0.05)。
　　 3.RT-PCR:膜聯(lián)蛋白A7在mRNA水平的表達(dá)情況為宮頸鱗癌組織表達(dá)高于正常宮頸組織(P＜0.05)。
　　 1.組織水平Annexin A7在人宮頸鱗癌中的表達(dá)比正常宮頸組織顯著增高。
　　

8、2.蛋白和分子水平Annexin A7在人宮頸鱗癌中的表達(dá)比正常宮頸組織高。
　　 3.Annexin A7與宮頸鱗癌的發(fā)生有關(guān)。
　　 第二部分、膜聯(lián)蛋白A7低表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖及凋亡的影響研究
　　 目的：探討膜聯(lián)蛋白A7的低表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的增殖和凋亡是否產(chǎn)生影響。
　　 方法：
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot鑒定人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A7

9、的表達(dá)。
　　 2.Western blot鑒定siRNA干擾對(duì)膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)的抑制效果。
　　 3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA抑制膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)后對(duì)HeLa細(xì)胞增殖情況的影響。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測(cè)siRNA抑制膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)后對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示Hela細(xì)胞內(nèi)有膜聯(lián)蛋白A7的表達(dá)。
　

10、　 2.MTT實(shí)驗(yàn)顯示：siRNA干擾組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較細(xì)胞增殖速度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，siRNA干擾組細(xì)胞凋亡顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示：siRNA干擾組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較凋亡增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

11、＜0.05)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.膜聯(lián)蛋白A7的低表達(dá)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的增殖未發(fā)現(xiàn)明顯影響。
　　 2.膜聯(lián)蛋白A7的低表達(dá)促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的凋亡。
　　 3.膜聯(lián)蛋白A7可能具有抑制宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞凋亡的作用。
　　 目的：初步探討膜聯(lián)蛋白A7影響HeLa細(xì)胞凋亡的可能機(jī)理。
　　 方法：

12、
　　 1.應(yīng)用western blot檢測(cè)siRNA干擾組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組Bax、Bcl-2、Fas、Fasl、Apaf-1的表達(dá)情況。
　　 2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)siRNA干擾組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組Bax、Bcl-2、Fas、 Fasl、 Apaf-1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 l.Western blot
　　 (1)Bax:siRNA干擾組其表達(dá)高于陰性對(duì)照組和空白

13、對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 (2)Bcl-2:siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 (3) Fas:siRNA干擾組其表達(dá)高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 (4) Fasl:siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5) Apaf-1:siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

14、P＞0.05）。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)
　　 (1)Bax:siRNA干擾組bax表達(dá)增高，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 (2)Bcl-2:siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (3)Fas:siRNA干擾組fas表達(dá)增高，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 (4)Fasl:siRN

15、A干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)Apaf-1:siRNA干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.當(dāng)AnnexinA7的表達(dá)被抑制，Bax在siRNA干擾組表達(dá)增高，說(shuō)明ANXA7基因有可能是凋亡抑制基因。
　　 2.當(dāng)AnnexinA7的表達(dá)被抑制，F(xiàn)as在siRNA干擾組表達(dá)增高，提示ANXA7對(duì)H