放射性肝損傷的發(fā)病機(jī)制及防治策略研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(PLC)是常見(jiàn)惡性腫瘤，盡管根治手術(shù)切除和肝移植仍為肝癌獲得根治的主要途徑，但80％患者明確診斷后即失去根治手術(shù)機(jī)會(huì)。越來(lái)越多確鑿臨床數(shù)據(jù)表明肝癌是放射敏感腫瘤。放射性肝損傷(RILD)是繼發(fā)于肝臟放療后并發(fā)的最嚴(yán)重、制約劑量遞增的致死性并發(fā)癥。肝臟是僅次于骨髓、淋巴組織的放射敏感器官，然而體外肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞卻是放射抵抗細(xì)胞，很難用“經(jīng)典的靶細(xì)胞理論”解釋。前期研究中已經(jīng)證實(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境包括非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、放療后產(chǎn)生的細(xì)胞因子級(jí)

2、聯(lián)效應(yīng)參與肝臟放射損傷發(fā)生、發(fā)展，即放療后的非靶向性效應(yīng)(Non-target effect)在RILD中發(fā)揮重要作用。輻射誘導(dǎo)基因調(diào)控下多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信息傳遞，形成龐大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但它們之間的相互關(guān)系及調(diào)控模式仍不清楚。大量文獻(xiàn)支持肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞是放射敏感細(xì)胞，放療后釋放大量細(xì)胞因子是放射誘導(dǎo)非靶向性效應(yīng)的關(guān)鍵因素。已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)在放射性肝損傷顯著活化且高表達(dá)，TGF-β信號(hào)通路與RILD密

3、切相關(guān)，但其確切作用機(jī)制仍然不清楚，本研究將在前面研究的基礎(chǔ)上通過(guò)構(gòu)建攜帶目的基因的重組腺病毒基因治療阻斷TGF-β信號(hào)通路或抑制Kupffer細(xì)胞，研究放射誘導(dǎo)的非靶向性效應(yīng)與肝臟放射損傷的關(guān)系，從全新角度探索RILD分子機(jī)制及防控策略。
　　第一部分應(yīng)用Adliax系統(tǒng)構(gòu)建Tβ IIR-IgFc融合基因重組腺病毒
　　目的：應(yīng)用AdMax系統(tǒng)構(gòu)建攜帶Ⅱ型TGFβ受體(Tβ IIR)IgFc融合基因重組腺病毒，為進(jìn)一步研究

4、放射性肝纖維化干預(yù)打下基礎(chǔ)。
　　材料和方法：針對(duì)Tβ IIR設(shè)計(jì)引物，PCR目的基因Tβ IIR構(gòu)建PDC316-Tβ IIR；針對(duì)IgFc設(shè)計(jì)引物，PCR目的基因IgFc，連入PDC316-Tβ IIR構(gòu)建PDC316-T BIIR-IgFc；雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒，AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)由骨架質(zhì)粒：pBHGlox_E1，3Cre和穿梭質(zhì)粒：pDC316-2501組成。使用Lipofectam lne

5、2000法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝攜帶目的融合基因的重組腺病毒，少量提取重組腺病毒DNA檢測(cè)證實(shí)為復(fù)制缺陷型Tβ IIR-IgFc基因重組腺病毒后大量擴(kuò)增、生產(chǎn)、純化及鑒定。
　　結(jié)果：PCR擴(kuò)增Tβ RII基因，酶切連接到pDC316-cmv-EGFP空載體，提取質(zhì)粒酶切鑒定電泳檢測(cè)正確；PCR擴(kuò)增IgFC基因，酶切、連接PDC316-Tβ RII載體，再提取質(zhì)粒，根據(jù)PDC316載體序列設(shè)計(jì)引物，PCR瓊脂糖凝膠電泳與預(yù)期的目的基因

6、片段一致，測(cè)序鑒定正確。雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第9天出毒而在光學(xué)顯微鏡下觀察出毒現(xiàn)象表現(xiàn)為細(xì)胞變大變圓，呈“葡萄串”樣形態(tài)學(xué)特征，并開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑。轉(zhuǎn)染后第14天待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒，證明有感染能力病毒顆粒包裝成功。重組腺病毒經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物電泳觀察出現(xiàn)一條特異性預(yù)期條帶，證明該重組腺病毒攜帶目的基因。測(cè)得擴(kuò)增后病毒滴度為2.6×1012pfu/ml。
　　結(jié)論：應(yīng)用AdMax系統(tǒng)可方便、快捷地

7、構(gòu)建攜帶目融合基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
　　第二部分抑制 TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有效減輕大鼠放射性肝纖維化
　　目的：本研究擬通過(guò)攜帶可溶性Tβ IIR的復(fù)制缺陷性重組腺病毒(AdTβ RIIFc)選擇性阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療晚期放射性損傷，明確TGF-β在放射性肝纖維化(RILF)發(fā)展中作用機(jī)制，進(jìn)一步探索RILF的治療策略。
　　方法：RILF大鼠模型采用上腹部全肝30Gy單次照射，放療后活過(guò)6個(gè)月的大

8、鼠肝臟都出現(xiàn)晚期纖維化表現(xiàn)。隨機(jī)分成4組，第1組模型組(RILFM)；第2組攜帶目的基因重組腺病毒基因治療組：腹腔注射1×1011PFU AdTβ RIIFc；第3組空病毒對(duì)照組，腹腔注射相同劑量和滴度的對(duì)照病毒；第4組生理鹽水對(duì)照組，腹腔注射等體積的生理鹽水(SALINE)。
　　結(jié)果：抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有效抑制放射性誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、膠原蛋白-1(Col-I)和纖維粘連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)

9、表達(dá)；阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以減輕RILF階段慢性氧化應(yīng)急(Chronic Oxidative Stress，COS)DNA損傷。另外，抗TGF-β治療可以有效釋放TGF-β對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，提高肝細(xì)胞代償能力，有效緩解RILF對(duì)肝臟功能損傷。
　　結(jié)論：TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RILF的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有效緩解RILF。
　　第三部分抑制肝臟Kupffer細(xì)胞減輕放射誘導(dǎo)肝臟細(xì)

10、胞凋亡
　　目的：通過(guò)放療前三氯化釓抑制庫(kù)痞細(xì)胞(KCs)，全肝照射檢測(cè)其對(duì)放射誘導(dǎo)肝臟凋亡保護(hù)作用，研究抑制KCs對(duì)放射性肝損傷的防護(hù)作用，從非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用全新角度探索放射性肝臟損傷RILD)的發(fā)病機(jī)制和防護(hù)策略。材料和方法：Sprague-Dawley大鼠放療前24小時(shí)腹腔注射三氯化釓(GdCl310mg/kg體重)清除肝內(nèi)KCs。大鼠隨機(jī)分為4組：第1組假照射腹腔注射生理鹽水；第2組假照射腹腔注射GdC13；第

11、3組腹腔注射生理鹽水全肝照射；第4組腹腔注射GdC13全肝照射。腹腔注射GdCl3后不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)KCs特異性免疫抗原CD-163(ED2)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝臟KCs數(shù)量，確認(rèn)GdC13對(duì)肝內(nèi)KCs細(xì)胞的抑制作用。放療后不同時(shí)點(diǎn)全麻下去肝臟及血清標(biāo)本，檢測(cè)凋亡相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β基因和蛋白表達(dá)情況。通過(guò)肝細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞微核技數(shù)評(píng)估放射誘導(dǎo)肝臟凋亡，進(jìn)一步通過(guò)肝臟組織病理學(xué)和血清酶學(xué)改變?cè)u(píng)估肝臟損

12、傷程度。
　　結(jié)果：腹腔注射GdC13對(duì)肝臟沒(méi)有明顯毒副作用，CD163(ED2)是肝內(nèi)KCs細(xì)胞的標(biāo)記物，GdC13注射后門(mén)脈周?chē)鶨D2陽(yáng)性KCs細(xì)胞數(shù)0，2，6，24和48小時(shí)分別是正常情況下11.8％±4.5％，11.5％±2.5％，12.5％±4.2％，9.5％±4.8％和12.5％±4.1％；小葉中心區(qū)域分別為7.9％±3.1％，8.2％±3.4％，9.3％±2.4％，8.0％±1.4％和9.5％±1.9％。第3組放療后

13、肝內(nèi)凋亡細(xì)胞開(kāi)始增多，6小時(shí)肝內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，第4組凋亡細(xì)胞數(shù)在放療后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著低于第3組。通過(guò)雙標(biāo)記技術(shù)顯示放療后6小時(shí)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞，第4組顯著低于第3組。微核技術(shù)是反映射線對(duì)染色體損傷簡(jiǎn)單而有效的方法，30Gy照射組肝細(xì)胞微核數(shù)達(dá)到19.8％±5.5％，GdC13腹腔注射后減少到7.9％±2.6％。通過(guò)肝臟酶學(xué)和組織病理學(xué)分析都同樣顯示GdC13抑制KCs細(xì)胞對(duì)放射性肝損傷的顯著保護(hù)作用。抑制KCs后放射性肝損傷