放射性肝損傷的發(fā)病機制及防治策略研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(PLC)是常見惡性腫瘤，盡管根治手術切除和肝移植仍為肝癌獲得根治的主要途徑，但80％患者明確診斷后即失去根治手術機會。越來越多確鑿臨床數(shù)據(jù)表明肝癌是放射敏感腫瘤。放射性肝損傷(RILD)是繼發(fā)于肝臟放療后并發(fā)的最嚴重、制約劑量遞增的致死性并發(fā)癥。肝臟是僅次于骨髓、淋巴組織的放射敏感器官，然而體外肝實質細胞卻是放射抵抗細胞，很難用“經典的靶細胞理論”解釋。前期研究中已經證實肝實質細胞微環(huán)境包括非實質細胞、放療后產生的細胞因子級

2、聯(lián)效應參與肝臟放射損傷發(fā)生、發(fā)展，即放療后的非靶向性效應(Non-target effect)在RILD中發(fā)揮重要作用。輻射誘導基因調控下多條信號傳導途徑進行細胞內及細胞間的信息傳遞，形成龐大調控網絡，但它們之間的相互關系及調控模式仍不清楚。大量文獻支持肝臟非實質細胞是放射敏感細胞，放療后釋放大量細胞因子是放射誘導非靶向性效應的關鍵因素。已經證實轉化生長因子-β(TGF-β)在放射性肝損傷顯著活化且高表達，TGF-β信號通路與RILD密

3、切相關，但其確切作用機制仍然不清楚，本研究將在前面研究的基礎上通過構建攜帶目的基因的重組腺病毒基因治療阻斷TGF-β信號通路或抑制Kupffer細胞，研究放射誘導的非靶向性效應與肝臟放射損傷的關系，從全新角度探索RILD分子機制及防控策略。
　　第一部分應用Adliax系統(tǒng)構建Tβ IIR-IgFc融合基因重組腺病毒
　　目的：應用AdMax系統(tǒng)構建攜帶Ⅱ型TGFβ受體(Tβ IIR)IgFc融合基因重組腺病毒，為進一步研究

4、放射性肝纖維化干預打下基礎。
　　材料和方法：針對Tβ IIR設計引物，PCR目的基因Tβ IIR構建PDC316-Tβ IIR；針對IgFc設計引物，PCR目的基因IgFc，連入PDC316-Tβ IIR構建PDC316-T BIIR-IgFc；雙質粒共轉染293細胞，同源重組產生重組腺病毒，AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)由骨架質粒：pBHGlox_E1，3Cre和穿梭質粒：pDC316-2501組成。使用Lipofectam lne

5、2000法轉染293細胞包裝攜帶目的融合基因的重組腺病毒，少量提取重組腺病毒DNA檢測證實為復制缺陷型Tβ IIR-IgFc基因重組腺病毒后大量擴增、生產、純化及鑒定。
　　結果：PCR擴增Tβ RII基因，酶切連接到pDC316-cmv-EGFP空載體，提取質粒酶切鑒定電泳檢測正確；PCR擴增IgFC基因，酶切、連接PDC316-Tβ RII載體，再提取質粒，根據(jù)PDC316載體序列設計引物，PCR瓊脂糖凝膠電泳與預期的目的基因

6、片段一致，測序鑒定正確。雙質粒共轉染293細胞，轉染后第9天出毒而在光學顯微鏡下觀察出毒現(xiàn)象表現(xiàn)為細胞變大變圓，呈“葡萄串”樣形態(tài)學特征，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。轉染后第14天待細胞大部分病變并從底部脫落進行收毒，證明有感染能力病毒顆粒包裝成功。重組腺病毒經RT-PCR擴增后，產物電泳觀察出現(xiàn)一條特異性預期條帶，證明該重組腺病毒攜帶目的基因。測得擴增后病毒滴度為2.6×1012pfu/ml。
　　結論：應用AdMax系統(tǒng)可方便、快捷地

7、構建攜帶目融合基因的復制缺陷型重組腺病毒。
　　第二部分抑制 TGF-β信號轉導通路有效減輕大鼠放射性肝纖維化
　　目的：本研究擬通過攜帶可溶性Tβ IIR的復制缺陷性重組腺病毒(AdTβ RIIFc)選擇性阻斷TGF-β信號轉導通路治療晚期放射性損傷，明確TGF-β在放射性肝纖維化(RILF)發(fā)展中作用機制，進一步探索RILF的治療策略。
　　方法：RILF大鼠模型采用上腹部全肝30Gy單次照射，放療后活過6個月的大

8、鼠肝臟都出現(xiàn)晚期纖維化表現(xiàn)。隨機分成4組，第1組模型組(RILFM)；第2組攜帶目的基因重組腺病毒基因治療組：腹腔注射1×1011PFU AdTβ RIIFc；第3組空病毒對照組，腹腔注射相同劑量和滴度的對照病毒；第4組生理鹽水對照組，腹腔注射等體積的生理鹽水(SALINE)。
　　結果：抑制TGF-β信號轉導通路有效抑制放射性誘導肝星狀細胞(HSC)活化、膠原蛋白-1(Col-I)和纖維粘連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)

9、表達；阻斷TGF-β信號轉導通路可以減輕RILF階段慢性氧化應急(Chronic Oxidative Stress，COS)DNA損傷。另外，抗TGF-β治療可以有效釋放TGF-β對肝細胞生長抑制效應，提高肝細胞代償能力，有效緩解RILF對肝臟功能損傷。
　　結論：TGF-β信號轉導通路在RILF的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，阻斷TGF-β信號轉導通路有效緩解RILF。
　　第三部分抑制肝臟Kupffer細胞減輕放射誘導肝臟細

10、胞凋亡
　　目的：通過放療前三氯化釓抑制庫痞細胞(KCs)，全肝照射檢測其對放射誘導肝臟凋亡保護作用，研究抑制KCs對放射性肝損傷的防護作用，從非實質細胞和實質細胞相互作用全新角度探索放射性肝臟損傷RILD)的發(fā)病機制和防護策略。材料和方法：Sprague-Dawley大鼠放療前24小時腹腔注射三氯化釓(GdCl310mg/kg體重)清除肝內KCs。大鼠隨機分為4組：第1組假照射腹腔注射生理鹽水；第2組假照射腹腔注射GdC13；第

11、3組腹腔注射生理鹽水全肝照射；第4組腹腔注射GdC13全肝照射。腹腔注射GdCl3后不同時間點通過KCs特異性免疫抗原CD-163(ED2)免疫組織化學染色檢測肝臟KCs數(shù)量，確認GdC13對肝內KCs細胞的抑制作用。放療后不同時點全麻下去肝臟及血清標本，檢測凋亡相關細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β基因和蛋白表達情況。通過肝細胞和肝內皮細胞凋亡、肝細胞微核技數(shù)評估放射誘導肝臟凋亡，進一步通過肝臟組織病理學和血清酶學改變評估肝臟損

12、傷程度。
　　結果：腹腔注射GdC13對肝臟沒有明顯毒副作用，CD163(ED2)是肝內KCs細胞的標記物，GdC13注射后門脈周圍ED2陽性KCs細胞數(shù)0，2，6，24和48小時分別是正常情況下11.8％±4.5％，11.5％±2.5％，12.5％±4.2％，9.5％±4.8％和12.5％±4.1％；小葉中心區(qū)域分別為7.9％±3.1％，8.2％±3.4％，9.3％±2.4％，8.0％±1.4％和9.5％±1.9％。第3組放療后

13、肝內凋亡細胞開始增多，6小時肝內凋亡細胞數(shù)達到高峰，第4組凋亡細胞數(shù)在放療后各個時間點都顯著低于第3組。通過雙標記技術顯示放療后6小時肝竇內皮細胞凋亡細胞，第4組顯著低于第3組。微核技術是反映射線對染色體損傷簡單而有效的方法，30Gy照射組肝細胞微核數(shù)達到19.8％±5.5％，GdC13腹腔注射后減少到7.9％±2.6％。通過肝臟酶學和組織病理學分析都同樣顯示GdC13抑制KCs細胞對放射性肝損傷的顯著保護作用。抑制KCs后放射性肝損傷