小麥白粉病小種特異抗性新基因Pm-M53的遺傳分析.pdf

1、由小麥?；桶追劬?BlumeriagraminisDCf.sp.tritici)引起的小麥白粉病幾乎在所有小麥生產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，已成為影響小麥生產(chǎn)的主要病害之一。培育抗病品種是防治其流行最有效、最安全的方法，而有利抗性基因資源的挖掘和高效利用則是培育抗病品種的前提，開展遺傳分析可為目標(biāo)基因的高效利用和后續(xù)的克隆及其抗病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 M53(YAV2/TEZ//Aegilopssquarrosa249)是硬粒小麥(Triti

2、cumdurum，2n=4x=28,AABB)與粗山羊草(Aegilopstauschii,2n=2x=14，DD)的雙二倍體人工合成種，其對(duì)北京地區(qū)白粉菌主流小種15號(hào)和揚(yáng)州地區(qū)主流小種表現(xiàn)免疫。本研究通過抗譜分析研究了抗性基因的來源、遺傳模式以及與已命名白粉病抗性基因在抗譜上的差異；利用AFLP和SSR標(biāo)記以及非整倍體分析對(duì)目的基因進(jìn)行了染色體定位和遺傳作圖；利用抗病基因具有保守功能域的特點(diǎn)，采用同源克隆的方法從M53基因組DNA中

3、分離了抗病基因類似片段(RGA)，結(jié)果如下：對(duì)抗病親本M53和感病親本宛7107的正反交F1以及F2和F3分離群體進(jìn)行了白粉菌接種，結(jié)果表明，F(xiàn)1正反交均表現(xiàn)為抗病，說明抗性受顯性核基因控制，而F2單株則表現(xiàn)出抗感分離，x2測(cè)驗(yàn)表明，抗感分離比例符合3∶1，達(dá)顯著水平，說明抗性受顯性單基因控制。F3代植株的接種鑒定證實(shí)了F2代表型鑒定結(jié)果的可靠性。為了追蹤抗性基因的來源，我們對(duì)M53及其雙親Triticumdurum(YAV2/TEZ)

4、和Ae.squarrosa249分別在苗期和成株期進(jìn)行接種鑒定，結(jié)果表明，YAV2/TEZ在兩個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)高感，而M53和Ae.squarrosa249則全生育期表現(xiàn)免疫，說明抗性基因來自Ae.squarrosa249，即來自粗山羊草，該基因暫命名為Pm-M53。 截至目前，已定名的白粉病抗性基因中，總共有3個(gè)位于D組染色體上，分別為Pm2，Pm19和Pm24，對(duì)其載體品種Ulka/8*Cc、XX186和赤鴨草進(jìn)行了白粉菌15號(hào)

5、生理小種接種鑒定，結(jié)果表明，Pm-M53在全生育期表現(xiàn)抗病，Pm19和Pm24則在全生育期表現(xiàn)感??；Pm2在苗期表現(xiàn)抗病，而在成株期表現(xiàn)感病，另外14個(gè)白粉菌生理小種在苗期接種也顯示Pm-M53在抗譜上不同于Pm2、Pm19和Pm24，對(duì)其中5個(gè)小種表現(xiàn)感病，說明Pm-M53是小種特異性(race-specific)抗病基因，可能是一個(gè)新的白粉病抗性基因。 分子標(biāo)記技術(shù)已成為培育抗病品種、基因定位、遺傳作圖及圖位克隆基因的主要手

6、段和技術(shù)之一，目前已被廣泛的應(yīng)用于白粉病的研究。本研究結(jié)合AFLP、SSR和BSA技術(shù)，對(duì)來自雜交組合M53/宛7107的F2作圖群體進(jìn)行了分析，在256對(duì)AFLP引物中，所有引物對(duì)在親本M53和宛7107間都能擴(kuò)增出30個(gè)以上位點(diǎn)，每對(duì)引物能夠檢測(cè)到1～11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，在抗感池間篩選到多態(tài)性片段16個(gè)，其中Apm109和Apm161兩個(gè)片段在抗親和抗池中能夠穩(wěn)定重現(xiàn)，而在感親和感池中無此帶，用JoinMapV3.0和Kosambi公

7、式對(duì)F2作圖群體的分析結(jié)果表明，這兩個(gè)片段與目的基因緊密連鎖，且位于目的基因的兩側(cè)，遺傳距離分別為1.0和3.0cM。標(biāo)記Apm109在F3的抗病單株中也能夠穩(wěn)定重現(xiàn)。從70個(gè)位于D組染色體的SSR標(biāo)記中，在親本及抗感池間篩選到重現(xiàn)性好的多態(tài)性標(biāo)記標(biāo)記5個(gè)，分別為Xwmc289，Xgwm583，Xgwm292，Xgwm191和Xwmc161，除Xgwm191位于5DS上外，其余4個(gè)標(biāo)記均位于5DL上。對(duì)上述多態(tài)性SSR標(biāo)記在群體中的分布

8、進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在LOD閾值為3.0時(shí)，位于5DL上的3個(gè)SSR標(biāo)記Xwmc289、Xgwm583和Xgwm292與目的基因連鎖，遺傳距離分別為20.0、33.0和24.0cM，并且分布于目的基因的兩側(cè)，初步說明目的基因位于5DL上。其中標(biāo)記Xwmc289在M53和宛7107各存在兩個(gè)共遷移片段，這兩個(gè)共遷移片段在序列上存在很大差異，但均具有1個(gè)CT重復(fù)域和1個(gè)GA重復(fù)域，在M53中共遷移的兩個(gè)目的片段的大小為159bp，在宛71

9、07中對(duì)應(yīng)的兩個(gè)共遷移片段的大小為161bp，相對(duì)應(yīng)的等位位點(diǎn)之間均有3個(gè)堿基的差異，一個(gè)為C/G堿基替換，另一個(gè)為GA重復(fù)域缺失。 利用JoinMapV3.0對(duì)兩個(gè)AFLP標(biāo)記Apm109和Apm161，以及3個(gè)SSR標(biāo)記Xwmc289、Xgwm583和Xgwm292聯(lián)合進(jìn)行了遺傳作圖，結(jié)果表明這些標(biāo)記分布在目的基因Pm-M53的雙側(cè)，SSR標(biāo)記Xgwm583和Xwmc289以及AFLP標(biāo)記Apm161分布在一側(cè)，Xgwm29

10、2和AFLPApm109分布在目的基因的另一側(cè)。從著絲粒近端(proximal)到遠(yuǎn)端(distal)的排列次序依次為Xgwm583、Xwmc289、Apm161、Pm-M53、Apm109、Xgwm292.其中3個(gè)SSR標(biāo)記在染色體上的排列順序與已經(jīng)建立的小麥整合圖譜是一致的，但標(biāo)記之間的距離存在一定差異。由于兩個(gè)AFLP標(biāo)記Apm109和Apm161距離目的基因較近且位于目的基因的雙側(cè)，而3個(gè)位于5DL上的SSR標(biāo)記又覆蓋目標(biāo)基因雙

11、側(cè)的兩個(gè)AFLP標(biāo)記區(qū)，進(jìn)一步說明目的基因Pm-M53位于5DL上，這點(diǎn)也通過距離目的基因最近的AFLP標(biāo)記Apm109在兩個(gè)中國(guó)春缺-四體材料(CSN5BT5D、CSN5DT5B)及兩個(gè)雙端體材料(CSDT5DS、CSDT5DL)中的擴(kuò)增情況進(jìn)行了證實(shí)，標(biāo)記Apm109在CSN5BT5D和CSDT5DL上有目的特異帶，而在CSN5DT5B和CSDT5DS上無此條帶。 在植物-病原菌相互作用中，不論何種植物類型還是與其作用的何種

12、病原菌，植物抗病基因在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，因此根據(jù)R基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異或兼并引物、用PCR的方法從基因組DNA或誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本cDNA中尋找和克隆抗病基因是常用的方法。本研究根據(jù)GenBank中粗山羊草的部分抗病序列以及已克隆的大、小麥抗白粉病基因的核苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)了非兼并和兼并引物，在M53和宛7107以及F2單株組成的抗感池基因組DNA中進(jìn)行了擴(kuò)增，平均每對(duì)引物能夠擴(kuò)增出8個(gè)以上的位點(diǎn)。非兼并引物對(duì)RGAP-2和RGAP

13、-6分別能夠擴(kuò)增出一條和兩條多態(tài)性條帶，即抗親M53和抗池中有帶，而在感親和感池中無帶，而所有兼并引物對(duì)在6％聚丙烯酰胺變性膠上均未擴(kuò)增出肉眼可辨的多態(tài)性條帶。我們對(duì)RGAP-2和RGAP-6產(chǎn)生的多態(tài)性片段分別進(jìn)行了回收、克隆和測(cè)序，RGAP-2多態(tài)性片段大小331bp，而RGAP-6多態(tài)性片段之一的大小為259bp。對(duì)RGAP-2(331bp)和RGAP-6(259bp)的核苷酸序列在NCBI(http：//www.ncbi.nih

14、.gov/BLAST/)中進(jìn)行相似性搜索(BLASTN)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與RGAP-2和RGAP-6目的片段相似性最高的幾個(gè)序列均來自粗山羊草，且都與抗病有關(guān)，具有明顯的LZ-NBS-LRR或NBS-LRR抗病結(jié)構(gòu)保守域。利用DNAStar軟件的EditSeq模塊對(duì)RGAP-6和RGAP-2多態(tài)性片段進(jìn)行了核苷酸到氨基酸的序列翻譯，RGAP-6(259bp)多態(tài)性片段無法翻譯成氨基酸，而RGAP-2(331bp)能夠翻譯成氨基酸，推測(cè)RGAP-

15、6(259bp)可能是內(nèi)含子或者調(diào)控序列的一部分，而RGAP-2很可能是表達(dá)序列(外顯子)的一部分。利用NCBI中的BLASTX對(duì)RGAP-2翻譯的氨基酸序列進(jìn)行同源搜索時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有命中的序列均與抗病有關(guān)，且與來自粗山羊草的LZ-NBS-LRR型抗病蛋白序列同源性最高。在與RGAP-2同源性較高氨基酸序列的比較中發(fā)現(xiàn)，RGAP-2目的片段及其同源序列在I(V/L)IDD(K/I)WDK、N(N/E)CGSR(I/V)I(T/A)TTRI

16、、PLS、KIL、KCGGVPLAⅡ等序列上高度保守，與已知R基因NB功能域的kinase2、kinase3a和GLPLAⅡ3個(gè)結(jié)構(gòu)域具有一定的相似性。在NCBI中利用rpsblast進(jìn)行功能域搜索時(shí)發(fā)現(xiàn)RGAP-2目的片段含有保守域NB-ARC，與來自擬蘭芥的R基因RPS-2、RPM1、RPP8和RPP13，番茄的R基因Prf、I2C-1和I2C-2，亞麻的R基因L6，以及與人和果蠅程序性死亡相關(guān)蛋白具有較高同源性，這些結(jié)果表明RGA

17、P-2和RGAP-6兩個(gè)感興趣片段極可能來自粗山羊草，而RGAP-2很可能與粗山羊草的抗病性有關(guān)，但較低的相似性得分與較高的E值暗示這兩個(gè)序列不同于任何已知的粗山羊草序列。 此外，本文還就目的基因Pm-M53與已定名白粉病抗性基因的關(guān)系、白粉病的表型鑒定、Pm-M53遺傳圖譜與已構(gòu)建遺傳圖譜的差異、位點(diǎn)特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化，以及克隆的RGA片段與禾本科中已克隆R基因的關(guān)系、與植物中已克隆的白粉病抗性基因的關(guān)系、與小麥和大麥中白粉菌誘