煙曲霉暴露加重支氣管哮喘機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴探討慢性煙曲霉暴露對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥、氣道重構(gòu)、氣道反應(yīng)性、黏蛋白5AC(MUC5AC)及表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR表達(dá)的影響。⑵探討煙曲霉對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE MUC5AC表達(dá)的影響及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法：①56只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為7組(每組8只)：(I)慢性哮喘組：應(yīng)用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)系統(tǒng)致敏和反復(fù)激發(fā)的方法制備大鼠慢性哮喘模型；(II-IV)慢性哮喘+煙曲霉孢子吸入1周

2、、3周和5周組：慢性哮喘大鼠經(jīng)鼻吸入煙曲霉孢子1周、3周和5周；(V)慢性哮喘+生理鹽水吸入組：慢性哮喘大鼠經(jīng)鼻吸入生理鹽水5周；(VI) OVA致敏生理鹽水激發(fā)組：應(yīng)用OVA致敏大鼠，生理鹽水激發(fā)；(VII) OVA致敏生理鹽水激發(fā)+煙曲霉孢子吸入組：應(yīng)用OVA致敏大鼠，生理鹽水激發(fā)，然后經(jīng)鼻吸入煙曲霉孢子5周。測(cè)定血清總IgE水平及肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)、白介素13(interleukin-13，IL-13)

3、、IL-5、γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tansforming growth factor-β，TGF-β)水平；測(cè)定大鼠氣道阻力(airway resistance，Raw)和應(yīng)用乙酰膽堿后Raw的變化率；肺組織切片行HE、PAS、Masson三色及GMS染色，并行病理圖像形態(tài)學(xué)測(cè)定和分析；免疫組化、RT-PCR及Western blot等檢測(cè)大鼠氣道上皮MUC5AC和EGFR的表達(dá)，ELISA

4、測(cè)定BALF中MUC5AC及EGFR配體EGF和TGF-α的水平。②16HBE細(xì)胞分為4組：正常溶劑對(duì)照組、煙曲霉提取物(AFE)處理組、AFE+選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1478作用組和AFE+MAPK激酶(MEK)抑制劑PD98059作用組。免疫熒光、免疫組化、RT-PCR、Western blot及ELISA等方法測(cè)定EGFR、ERK1/2、phospho-EGFR、phospho-ERK1/2及MUC5AC的表達(dá)。

5、 結(jié)果：⑴哮喘大鼠吸入煙曲霉孢子1周后血清總IgE水平、BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、IL-13、IL-5及TGF-β水平、氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞損傷脫落、杯狀細(xì)胞增生程度及上皮下纖維化程度較吸入前升高或加重，氣道反應(yīng)性變化不明顯；吸入3周后，氣道反應(yīng)性較吸入前增高；吸入5周后上述變化更為明顯，表現(xiàn)為明顯的劑量依賴(lài)性。長(zhǎng)期吸入煙曲霉孢子，可致孢子在哮喘大鼠肺內(nèi)滯留，但未發(fā)生氣道定植或侵襲性感染。吸入煙曲霉孢子

6、可劑量依賴(lài)性上調(diào)哮喘大鼠氣道上皮MUC5AC的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與杯狀細(xì)胞增生程度正相關(guān)：BALF中IL-13水平與MUC5AC表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)。慢性煙曲霉暴露可劑量依賴(lài)性上調(diào)哮喘大鼠氣道上皮EGFR的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與BALF中EGF、TGF-α水平及氣道上皮損傷脫落程度正相關(guān)。OVA致敏生理鹽水激發(fā)大鼠吸人煙曲霉孢子5周后上述指標(biāo)均無(wú)明顯變化；慢性哮喘大鼠吸入生理鹽水5周后氣道炎癥和氣道上皮損傷脫落有一定程度的改善，而杯狀細(xì)胞增生、上皮

7、下膠原沉積及氣道高反應(yīng)性變化不明顯。哮喘大鼠吸入煙曲霉孢子后，氣道重構(gòu)指標(biāo)與氣道反應(yīng)性正相關(guān)。⑵8-24mg/L AFE與16HBE共孵育24h，可劑量依賴(lài)性上調(diào)EGFR和ERK1/2表達(dá)；16mg/L AFE與16HBE共孵育1h，可誘導(dǎo)EGFR和ERK1/2磷酸化；16HBE與10μM/L的AG1478作用可抑制AFE誘導(dǎo)的EGFR和ERK1/2的磷酸化，與30μM/L的MAPK激酶(MEK)抑制劑PD98059作用可抑制ERK1/

8、2的磷酸化，而不影響EGFR的磷酸化。16mg/L的AFE可上調(diào)16HBE MUC5AC的表達(dá)，與AG1478或PD98059作用可抑制AFE誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)。 結(jié)論：①在慢性過(guò)敏性氣道炎癥存在的情況下，哮喘大鼠對(duì)煙曲霉暴露的反應(yīng)與正常大鼠不同。煙曲霉暴露可以加重哮喘大鼠的Th2型氣道炎癥，氣道上皮損傷程度進(jìn)一步加重，EGFR和MUC5AC表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和黏液過(guò)度分泌，促進(jìn)氣道上皮下纖維化，增加氣道反應(yīng)性，上述反