一葉萩堿生物合成與生物轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、一葉萩堿是一種GABA受體特異性拮抗劑，具有顯著的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用，已經(jīng)成為神經(jīng)內(nèi)科重要的臨床用藥、及常用的工具藥。最新的研究結(jié)果還表明，一葉萩堿能顯著改善學(xué)習(xí)、記憶，有可能發(fā)展成為預(yù)防及治療老年性癡呆癥(AD)的藥物。除此之外，一葉萩堿還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗瘧、抗細(xì)菌、抗病毒等廣泛的生物活性。因此，近年來關(guān)于一葉萩生物堿的研究增長很快。一葉萩堿在一葉萩植物中的生物合成顯示了十分獨(dú)特的旋光現(xiàn)象：不同地區(qū)的同種一葉萩植物能特異地生物合

2、成不同旋光的一葉萩堿。另外，一葉萩堿化學(xué)結(jié)構(gòu)的剛性和手性使得化學(xué)全合成和化學(xué)衍生難度很大。因此，對(duì)一葉萩生物堿手性生物合成機(jī)理的研究無疑具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文對(duì)一葉萩堿生物合成及生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，包括以下四個(gè)方面的工作內(nèi)容： 1.一葉萩植物愈傷組織的培養(yǎng)和一葉萩堿的積累采集了三個(gè)不同來源——河北省興隆縣、北京市密云縣、北京市房山區(qū)上方山的一葉萩植物，誘導(dǎo)獲得了三個(gè)一葉萩愈傷組織的細(xì)胞株。確定了適合組織培養(yǎng)樣品處理及

3、其一葉萩堿含量的RP-HPLC分析方法。通過多種波譜學(xué)手段確證了誘導(dǎo)自北京市密云縣的一葉萩愈傷組織中積累右旋一葉萩堿；建立了應(yīng)用一種手性溶解劑(S)-(-)-N-鄰苯二甲酰丙氨酸((S)-(-)-N-Phthalylalanine)鑒定一葉萩堿樣品光學(xué)純度的方法。對(duì)影響愈傷組織生物量積累及一葉萩堿含量的多個(gè)因素——光照、基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、激素配比等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，光照、MS基本培養(yǎng)基、5％蔗糖濃度、16.11μMNAA和2.3

4、2μMKT的激素配比為愈傷組織生長和一葉萩堿積累的最適條件。 2.一葉萩植物愈傷組織的化學(xué)成分從一葉萩愈傷組織培養(yǎng)物中，通過常壓硅膠柱層析、制備薄層、凝膠分離及半制備HPLC等分離手段，共得到24個(gè)化合物，分別是：3β，12-二羥基-13-甲基6，8，11，13-羅漢松四烯(3β，12-dihydroxy-13-methyl-6，8，11，13-podocarpatetraen)(1)，3β，12-二羥基-13-甲基-5,8,1

5、1，13-羅漢松四烯-7-酮(3β，12-dihydroxy-13-methyl-5,11，13-podocarpatetraen-7-one)(2)，20(10→5)-阿貝-4,5-開環(huán)-5(10),6,8,11，13-羅漢松五烯-3-酮(20(10→5)-abeo-4,5-seco-5(10)，6，8，11，13-podocarpapentaen-3-one)(3)，右旋一葉萩堿(virosecurinine)(4)，右旋別一葉萩堿

6、(viroallosecurinine)(5)，14,15-二氫右旋一葉萩堿(14,15-dihydrovirosecurinine)(6)，ent-Phyllanthidine(7)，SecurinolA(8)，2,8-epi-SecurinolA(9)，山柰酚(kaempferol)(10)，山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷(kaempferol-3-O-β-D-rutinoside)(11)，蘆丁(rutin)(12)，β-谷甾醇

7、(β-sitosterol)和β-豆甾醇(β-stigmasterol)混合物(13、14)，胡蘿卜甙(daucosterol)、豆甾醇葡萄糖甙(stigmasterolglucoside)混合物(15、16)，SitoindosideI(stigmast-5-en-3-ol-O-(6-O-hexadecanoyl--D-glucopyranoside)和Stigmast-7,22-dien-3-ol-O-(6-O-hexadecano

8、yl--D-glucopyranoside)混合物(17、18)，(-)-Dihydroaquilegiolide(19)，鄰羥基苯乙酸(2-hydroxyphenylaceticacid)(20)，對(duì)羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylaceticacid)(21)，半乳糖醇(galactitol)(22)，三十四烷醇(tetratriacontanol)(23)，三十二烷酸(dotriacontanoicacid)(24)。其

9、中化合物1、2、3為新化合物，藥理活性篩選結(jié)果顯示，這3個(gè)化合物均具有一定的細(xì)胞毒活性。 3.一葉萩堿的生物合成途徑研究由一葉萩愈傷組織培養(yǎng)物中分離得到了化合物(-)-dihydroaquilegiolide和對(duì)羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylaceticacid)這兩個(gè)化合物結(jié)構(gòu)提供的線索，結(jié)合前人的研究基礎(chǔ)，通過理論分析，提出了一條新的一葉萩生物堿可能的生物合成途徑，即從酪氨酸氧化到對(duì)羥基苯丙酮酸，再脫羧形成對(duì)羥基

10、扁桃酸，對(duì)羥基扁桃酸通過一個(gè)醌甲基中間體生物合成aquilegiolide，aquilegiolide與來源于賴氨酸的△1-piperdine通過一個(gè)Mannich-like關(guān)鍵反應(yīng)連接一葉萩堿的A環(huán)與C/D環(huán)。并對(duì)這一假設(shè)生物合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵中間體——aquilegiolide和對(duì)羥基扁桃酸(p-hydroxymandelicacid)與一葉萩堿的生物合成關(guān)系進(jìn)行了試驗(yàn)探索。試驗(yàn)了酸、堿、鈀催化的對(duì)羥基扁桃酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，并通

11、過氘代苯酚與乙醛酸的間接方法，制備了3′，5′-氘二取代的對(duì)羥基扁桃酸，其3′，5′位的氘代比例達(dá)63％。將氘代標(biāo)記的對(duì)羥基扁桃酸投入一葉萩植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，LC-MS分析其中一葉萩堿生物合成的結(jié)果顯示，約7％的一葉萩堿中摻入了氘代的對(duì)羥基扁桃酸前體，結(jié)果有利于提出的生物合成假設(shè)。 4.一葉萩堿的微生物轉(zhuǎn)化從河北興隆縣和北京房山區(qū)上方山采集的一葉萩植物中制備了一葉萩堿的4個(gè)異構(gòu)體(左旋一葉萩堿securinine，左旋別一葉萩

12、堿allosecurinine，右旋一葉萩堿virosecurinine，右旋別一葉萩堿viroallosecurinine)。對(duì)73株不同來源的微生物轉(zhuǎn)化左旋一葉萩堿的能力進(jìn)行了篩選，得到5株具有轉(zhuǎn)化能力的絲狀真菌。其中一株分離自一葉萩植物的內(nèi)生真菌葉2轉(zhuǎn)化左旋一葉萩堿得到兩個(gè)產(chǎn)物，為新化合物14,15-二氫-5α-羥基左旋一葉萩堿(7)，已知化合物14,15-二氫左旋一葉萩堿(8)；葉2同時(shí)可以對(duì)一葉萩堿的另外3個(gè)異構(gòu)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并

13、分別得到其對(duì)應(yīng)的14,15雙鍵還原產(chǎn)物——14,15-二氫左旋別一葉萩堿(9)，14，15-二氫右旋別一葉萩堿(10)，14,15-二氫右旋一葉萩堿(11)，其中14，15-二氫右旋別一葉萩堿(10)為新化合物。4株微生物轉(zhuǎn)化一葉萩堿4種異構(gòu)體的結(jié)果顯示，這4個(gè)微生物只能將左旋一葉萩堿和左旋別一葉萩堿轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的14,15雙鍵還原產(chǎn)物，而對(duì)右旋一葉萩堿和右旋別一葉萩堿不能轉(zhuǎn)化。對(duì)一葉萩堿14,15位雙鍵還原的轉(zhuǎn)化酶的初步研究表明，這個(gè)酶