非典型腸致病性大腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查與特性研究.pdf

1、典型和非典型腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)的很多特性都不相同，典型EPEC( typical EPEC，tEPEC)除了含有腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)(locus of enterocyteeffacement，LEE)毒力島外，還含有被稱為EPEC黏附因子(EPEC adherence factor，EAF)的質(zhì)粒，而非典型EPEC(atypical EPEC，aEPEC)僅含LE

2、E毒力島，不含EAF質(zhì)粒。tEPEC是發(fā)展中國(guó)家嬰兒發(fā)生腹瀉的一個(gè)首要原因，而發(fā)達(dá)國(guó)家則比較少，似乎aEPEC是更重要的腹瀉因素。tEPEC唯一的宿主是人，aEPEC，人和動(dòng)物都可以成為宿主。aEPEC和tEPEC在遺傳特征，血清型與毒力的特性也各不相同。aEPEC和STEC(產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌)的遺傳關(guān)系更為密切，這些菌株似乎是一類新出現(xiàn)的病原體。 為了解我國(guó)不同來(lái)源中aEPEC攜帶情況，對(duì)aEPEC的致病性做進(jìn)一步的探索，本

3、文開(kāi)展了以下的研究：(1)建立快速檢測(cè)粘附與脫落性大腸桿菌的分子生物學(xué)方法；(2)對(duì)不同來(lái)源的aEPEC的感染流行情況進(jìn)行初步調(diào)查研究；(3)對(duì)aEPEC可能的相關(guān)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)；(4)利用凝膠脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)對(duì)分離株進(jìn)行分析，追溯不同來(lái)源的aEPEC菌株間的相互關(guān)系。 一、黏附與脫落性大腸桿菌的PCR快速檢測(cè)方法的建立 利用PCR方法擴(kuò)增緊密素eaeA基因來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的純培養(yǎng)物，10株黏附與脫落性大腸桿菌(AEE

4、C)的PCR結(jié)果呈陽(yáng)性，而其他大腸桿菌包括非致病性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒素大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌和非大腸桿菌均未出現(xiàn)特異性的片段。對(duì)PCR擴(kuò)增的eaeA基因產(chǎn)物經(jīng)行序列測(cè)定，與參考株eaeA序列比對(duì)后一致。研究表明該P(yáng)CR體系能檢測(cè)出12pg的模板DNA。這表明PCR法對(duì)于AEEC的鑒定具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快和易操作的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)本研究基于EHEC0157:H7 EDL933W株和EPEC株的eaeA，bfpA、stxl、stx2四

5、個(gè)基因建立了多重PCR檢測(cè)方法，可以快速區(qū)分出EHEC、tEPEC和aEPEC，為EHEC和EPEC的感染和流行病學(xué)調(diào)查，提供了一種簡(jiǎn)便實(shí)用的技術(shù)手段。 二、非典型腸致病性大腸桿菌的流行病學(xué)調(diào)查 為了解我國(guó)人源和動(dòng)物源中aEPEC的攜帶情況，自2007年6月至2008年8月采集不同來(lái)源的樣本以增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和PCR方法進(jìn)行分離鑒定。統(tǒng)計(jì)分析表明，在808份醫(yī)院糞便樣品中，檢出AEEC陽(yáng)性140份，陽(yáng)性率為17.3％

6、。住院部的感染率高于門診部的。健康人群體檢樣本2606份，檢出陽(yáng)性樣品340份，陽(yáng)性率為13.0％。在117份生豬屠宰場(chǎng)樣品中，47份aEPEC陽(yáng)性，陽(yáng)性率為40.2％。奶牛場(chǎng)樣品231份，檢出aEPEC陽(yáng)性36份，陽(yáng)性率15.6％。寵物醫(yī)院樣品42份，檢出陽(yáng)性8份，陽(yáng)性率為19.0％。家禽市場(chǎng)鴨、鵝樣品共464份，陽(yáng)性23份，平均陽(yáng)性率4.96％。超市樣品599份，陽(yáng)性21份，陽(yáng)性率3.5％。從以上結(jié)果可以看出，該類細(xì)菌具有明顯的季節(jié)

7、性特征，夏秋季節(jié)的檢出率明顯高于冬春季節(jié)，aEPEC在不同群體的流行呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化，在鴨中未檢測(cè)到陽(yáng)性樣本，這可能和宿主特異性有關(guān)；豬群的感染率高于人群，加強(qiáng)對(duì)豬源aEPEC的控制，有助于預(yù)防和控制人腹瀉的發(fā)生和傳播；健康人群中aEPEC攜帶率也比較高，與國(guó)外相關(guān)報(bào)道基本一致，可能部分aEPEC菌株為非致病菌或?yàn)闂l件致病菌；寵物中攜帶率亦較高，對(duì)于嬰幼兒應(yīng)避免頻繁接觸寵物；超市樣本中，生豬肉和牛肉以及蝦中檢測(cè)到陽(yáng)性，可能為交叉污染或

8、本身帶菌，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)生熟食品的加工和存儲(chǔ)管理，避免交叉污染。 三、非典型腸致病大腸桿菌可能的毒力因子檢測(cè)分析 通過(guò)對(duì)186株不同來(lái)源的aEPEC分離株的相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，以找出毒力基因和致病性之間的聯(lián)系，為進(jìn)一步研究非典型EPEC奠定基礎(chǔ)。本研究共檢測(cè)了與致瀉大腸桿菌相關(guān)的基因escV、astA、ipaH、fuA、estA、estB、elt，檢出率分別為：93.0％、4.3％、0％、30.0％、10.8％、0.5％、0.5

9、％。這些菌株共鑒定出28個(gè)血清型：011、0115、0118、0123、0132、0139、0156、0188、038、040、049、062.063、065、074、078、080、0156、091、0107、088、024、0111、04、0145、0103、0117、09，但大部分菌株無(wú)法鑒定，這與國(guó)外的報(bào)道也相一致；對(duì)其進(jìn)行種系發(fā)生型分類，A型占38.7％、B1型占53.8％、B2型占3.2％、D型占4.3％，發(fā)現(xiàn)我國(guó)的aEPE

10、C分離株主要分布于A型和B1型；基因檢測(cè)顯示常見(jiàn)的毒力基因的攜帶率都較低，這可能和aEPEC特殊的致病機(jī)理相關(guān)。這些結(jié)果為研究aEPEC的毒力特性和致病機(jī)理積累了有用的資料。 四、不同源非典型腸致病性大腸桿菌分離株P(guān)FGE分子亞分型研究 47株不同源的非典型EPEC分離株P(guān)FGE圖譜可分為3個(gè)遺傳譜系，且我國(guó)非典型EPEC分離株中有2株分離株屬于遺傳譜系Ⅰ，15株屬于遺傳譜系Ⅱ，30株屬于遺傳譜系Ⅲ;分別占4.3％、31

11、.9％、63.8％，主要屬于遺傳譜系Ⅱ和Ⅲ。不同源分離株在譜系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中呈交叉分布。分析表明，健康人群分離株在Ⅰ、Ⅱ譜系中占優(yōu)勢(shì)；禽源在遺傳譜系Ⅲ中占優(yōu)勢(shì)；而腹瀉病人主要集中在遺傳譜系Ⅱ和Ⅲ;其他分離株在各譜系中均有分布，由此推測(cè)豬群和健康人群是aEPEC的主要攜帶者。根據(jù)PFGE進(jìn)化樹(shù)圖分析，以人源EDL9330157:H7標(biāo)準(zhǔn)株為參照，分離株C187與其親緣關(guān)系最為接近，而同一克隆亞群內(nèi)的其他分離株包含了健康人群、腹瀉人群、豬群、