基于不同長度的COI和COII基因片段分子鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲.pdf

1、一、季節(jié)性演替實(shí)驗(yàn)鑒定法醫(yī)學(xué)重要節(jié)肢動物
　　背景:
　　法醫(yī)昆蟲學(xué)(forensic entomology)研究內(nèi)容主要是對在尸體內(nèi)、尸體表面或尸體附近采集到的昆蟲標(biāo)本，進(jìn)行檢驗(yàn)、鑒定、分類后，明確昆蟲種類或確定某一昆蟲生長發(fā)育狀態(tài)，結(jié)合昆蟲在尸體上的生態(tài)群落演替，幫助法醫(yī)完成死亡時間(postmortem interval，PMI)的推斷。昆蟲在尸體上是按一定的次序出現(xiàn)并繁殖。目前，在埃及有關(guān)不同腐敗階段的動物區(qū)系演替實(shí)

2、驗(yàn)和他們在法律上應(yīng)用報(bào)道還很少。而且，也沒有埃及東北部有關(guān)法醫(yī)重要意義昆蟲的數(shù)據(jù)報(bào)道。
　　目的：
　　1.第一次在埃及東北部(32°15′E，30°36′N)調(diào)查法醫(yī)重要性意義的昆蟲。
　　2.調(diào)查冬夏季節(jié)動物尸體上的主要昆蟲類群，并分析尸體分解速度的季節(jié)性差異。
　　3.觀察最早到達(dá)尸體的雙翅目種類及嗜尸性昆蟲的演替規(guī)律。
　　方法:
　　1.連續(xù)2年(2011/2012)的冬夏季節(jié)用動物尸體進(jìn)行

3、實(shí)驗(yàn)。
　　2.在每次觀察中，檢查尸體的腐敗階段，采集不同發(fā)育階段的有代表性的樣本（死的和活著的樣本），并記錄溫度和相對濕度等環(huán)境變量。
　　3.請分類專家依據(jù)本地物種的形態(tài)學(xué)特征對物種行形態(tài)學(xué)鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.夏季在動物尸體上取得了3目7科10種的物種，而冬季在動物尸體上獲得了4目8科12種的物種。雖然在冬季可以收集到更豐富的樣本物種，但在夏季每個物種的樣本數(shù)量更多。
　　2.一般情況下，蠅科和

4、廁蠅科在夏季研究中占主導(dǎo)地位而麻蠅科在冬季占主導(dǎo)地位。
　　3.冬季動物尸體的分解的速度明顯慢于在夏季的速度。
　　4.相比夏季，在冬季雙翅目到達(dá)尸體明顯延遲。夏季最先到達(dá)尸體的類群是家蠅，而在冬季最先到達(dá)的白頭裸金蠅。
　　5.通過分析所收集到的樣本，構(gòu)建了夏季和冬季的物種的共生矩陣表。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果提示開展地域性昆蟲演替規(guī)律調(diào)查研究是十分重要的，在不同的區(qū)域范圍內(nèi)確定最有可能出現(xiàn)的昆蟲種類

5、對于法醫(yī)學(xué)案例也至關(guān)重要。演替實(shí)驗(yàn)也是評估分子標(biāo)記鑒定能力的一個基本步驟。
　　二、細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅰ(COI):利用短片段和長片斷鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲
　　背景：
　　在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，正確的鑒定是一個關(guān)鍵性的問題，因?yàn)橛腥毕莸姆ㄡt(yī)學(xué)證據(jù)可能導(dǎo)致審判不公。在以被準(zhǔn)確評估后的遺傳標(biāo)記為指導(dǎo)的鑒定工具包中，以分子為基礎(chǔ)的方法被認(rèn)為是一個重要工具。本文第一次使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅰ(COI)的272-bp和1173-b

6、p兩個片斷對來自埃及的嗜尸性昆蟲進(jìn)行評估。并且，由于現(xiàn)有中國的相關(guān)數(shù)據(jù)全部來自對短片段的研究，本文也第一次使用COI的長片斷對中國的嗜尸性昆蟲進(jìn)行評估。因此，這些研究對于確定以上片斷的適用性是非常有意義的。從兩個地區(qū)收集到的樣本對于使用這些分子標(biāo)記鑒定物種和種群具有重要意義。
　　目的：
　　確定COI長、短兩個片斷對于鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲的鑒別效力，并且通過以下三個方面評估和比較這兩個片斷:
　　1、種內(nèi)及種間差異<

7、br>　　2、所研究物種的單系分離
　　3、通過鄰接法建立于與分類學(xué)一致的系統(tǒng)發(fā)育樹確定這些片斷在種群水平上鑒定同種的鑒別效力。
　　方法：
　　1、形態(tài)學(xué)鑒定來自18個物種的50個樣本。
　　2、DNA提取。
　　3、使用兩個片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后產(chǎn)物直接用于測序。
　　4、使用Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)對核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì)算，通過鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結(jié)果

8、：
　　1、在種內(nèi)和種間差異中兩個片斷顯示了類似的結(jié)果。
　　2、長片斷能夠以高的自舉值完整地區(qū)分單系物種，明顯優(yōu)于短片段。
　　3、使用長片斷對這些物種建立的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與分類學(xué)結(jié)果較為一致，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于短片段。
　　結(jié)論：
　　1、COI長片段的鑒定結(jié)果更為可靠和安全，因?yàn)樗軌騼?yōu)化分歧，特別是對那些具有低水平分歧的物種。
　　2、長片斷另外一個優(yōu)點(diǎn)是除了能夠得到與形態(tài)學(xué)分類相一致的結(jié)果之外，還特別

9、適用于鑒定已建立本地?cái)?shù)據(jù)庫中的新物種。
　　3、在種群水平上COI基因不能區(qū)分同種昆蟲。
　　三、細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ:利用短片段鑒定嗜尸性雙翅目昆蟲
　　背景：
　　由于相對較高的變異度，細(xì)胞色素氧化酶基因Ⅱ可以成功用于進(jìn)化學(xué)研究、群體遺傳學(xué)和分類學(xué)。然而，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道使用該基因進(jìn)行嗜尸性蠅類鑒定。在將任何遺傳學(xué)標(biāo)記用于實(shí)際案例之前，需要對這些標(biāo)記進(jìn)行評估。為了作為可用的法醫(yī)學(xué)工具，這些標(biāo)記必須含有有效的變

10、異區(qū)能在種及種群水平上產(chǎn)生唯一的標(biāo)識。由于短片段具有簡單、低成本和很好的應(yīng)用前景，最近有文獻(xiàn)報(bào)道使用一個189-bp COII片段鑒定來自中國的3種麻蠅。目前，在埃及沒有使用該片斷發(fā)表的數(shù)據(jù)。因此，本研究利用該片斷鑒定來自兩個不同地區(qū)的三科昆蟲（家蠅科、麻蠅科和蠅科）14種蠅類，進(jìn)而評估該片斷的實(shí)用性。
　　目的：
　　通過以下方法評估長度小于200-bp小片段的使用性:
　　1、測量種內(nèi)及種間差異。
　　2、在

11、科水平上證實(shí)所研究物種的單系分離及正確歸類。
　　方法：
　　1、形態(tài)學(xué)鑒定來自14個物種的53個樣本。
　　2、DNA提取。
　　3、使用該片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后產(chǎn)物直接用于測序。
　　4、使用Kimura雙參數(shù)距離模型（K2P）對核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì)算，通過鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結(jié)果：
　　1、同種蠅類無種內(nèi)差異，種間差異為2％～25％。
　　2、除了H.mel

12、anura和秋家蠅M.autumnalis，所有樣品都正確的歸類。
　　結(jié)論：
　　盡管分子生物學(xué)對于鑒定嗜尸性昆蟲是一種有效的方法，然而我們建議小于小于200-bp小片段用于鑒定僅僅是對傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充。
　　四、章基于COI和COII基因利用PCR-RFLP技術(shù)鑒定嗜尸性麻蠅
　　背景：
　　利用麻蠅進(jìn)行死亡時間推斷是十分有限的，因?yàn)槁橄壍男螒B(tài)學(xué)鑒定十分困難，無論是在幼蟲、蛹還是成蟲階段，它們都具有相似的

13、特征。幾乎所有可用的PCR-RFLP數(shù)據(jù)都來自麗蠅科昆蟲。并且，對使用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行物種鑒定仍存在爭議。目前，尚無來自中國或埃及有關(guān)被檢驗(yàn)的物種和分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)。
　　目的：
　　1、評估部分COI-COII基因的使用性;基于直接測序鑒定四種常見的嗜尸性麻蠅。
　　2、評估該P(yáng)CR-RFLP技術(shù)的實(shí)用性;基于COI-COII片斷，PCR-RFLP作為一種簡單、快速和低成本的技術(shù)鑒定四種常見的嗜尸性麻蠅。

14、>　　方法：
　　1、形態(tài)學(xué)鑒定4個麻蠅物種。
　　2、DNA提取。
　　3、使用該片斷的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后產(chǎn)物直接用于測序。
　　4、使用限制性內(nèi)切酶HinfI和MfeI對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，使用電泳確定條帶圖譜。
　　5、使用Kimura雙參數(shù)距離模型(K2P)對核苷酸序列的分歧進(jìn)行計(jì)算，通過鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　結(jié)果
　　1、所有被檢測樣品都正確的歸類。
　　2、