耳蝸外毛細胞動力蛋白對聽覺靈敏度與頻率響應(yīng)的調(diào)控機制.pdf

1、隨著聾病機制研究的快速發(fā)展，對耳蝸主動放大機制的探索成為理解耳聾病發(fā)生機制的最關(guān)鍵的一環(huán)。以Prestin(Motor Protein，動力蛋白)為分子基礎(chǔ)的外毛細胞電運動(Electromotility)則是耳蝸主動放大機制形成的必要條件。1985年Brownell發(fā)現(xiàn)了細胞長度能隨電位的變化快速改變的外毛細胞電運動。外毛細胞這種獨一無二的外電運動的頻率高達110kHz，且不直接依賴于ATP與鈣離子的濃度，能夠?qū)β暡ㄒ鸬亩伝啄さ?/p>

2、振動進行放大和修飾，從而大大提高了內(nèi)耳敏感性和頻率選擇性。細胞膜低通濾波特性與高頻電運動之間的差異提示，外毛細胞壓電反應(yīng)(Piezoelectricity)在耳蝸機電轉(zhuǎn)換過程可能具有重要作用。2000年發(fā)現(xiàn)了編碼膜動力蛋白(Prestin)的基因Pres，隨后的工作證實了Prestin蛋白是外毛細胞電運動及壓電反應(yīng)所必須的分子基礎(chǔ)。自Prestin蛋白發(fā)現(xiàn)以來，其在聽覺調(diào)控機制中的作用及基本特性一直就是聽覺領(lǐng)域中的研究熱點。受各種因素的

3、制約，目前尚缺乏Prestin的在外毛細胞側(cè)膜中的存在形式、位置及更新機制的直接實驗證據(jù)。雖有藥物調(diào)控外毛細胞電運動的報道，但未見Prestin的表達能否被調(diào)控的報道。為了探索Prestin及對聽覺的調(diào)控機理，本研究試以Prestin蛋白在外毛細胞膜上的表達更新為切入點，綜合利用病理生理等技術(shù)方法，對外毛細胞電運動的調(diào)控機制及壓電反應(yīng)的意義進行初步研究，并結(jié)合實驗結(jié)果從提高聽覺靈敏度與頻率選擇性的角度對Prestin蛋白及其表達調(diào)控機制

4、進行分析討論。
　　 第一部分耳蝸外毛細胞基底細胞膜Prestin蛋白分布與表達的研究
　　 目的：本研究以明確OHC基底細胞膜上是否存在Prestin的表達及其在側(cè)膜三層結(jié)構(gòu)中的定位為目標，對Prestin蛋白的功能及可能的更新機制進行了探索。Prestin是外毛細胞電運動的分子基礎(chǔ)，特異性地表達在OHC側(cè)膜上，在胞漿、表皮板及纖毛上無表達。以往工作雖在外毛細胞膜中發(fā)現(xiàn)有高密度的蛋白顆粒分布，但未能確定這些蛋白顆粒與P

5、resin蛋白之間的關(guān)系及在基底細胞膜上的有無分布。
　　 方法：在本研究中，分別取正常小鼠、大鼠及豚鼠耳蝸的單離外毛細胞及全基底膜，在激光共聚焦顯微鏡下，利用Prestin特異性抗體與細胞膜標記di-8-ANEPPS雙染，對Prestin在兩種標本上的表達與分布情況進行了觀察。
　　 結(jié)果：(1)不僅OHC基底側(cè)膜上存在Prestin抗體的陽性染色，OHC底端細胞膜上亦見陽性染色，但其熒光強度僅為側(cè)膜的80.5％和61

6、.1％；(2)與細胞膜標記di-8-ANEPPS染色相比，Prestin抗體的陽性染色位于細胞膜的外側(cè)；經(jīng)低滲細胞外液處理后，OHC側(cè)膜中的質(zhì)膜層可與SSL和CL分離，在激光共聚焦顯微鏡下，外毛細胞膜最外側(cè)的質(zhì)膜層上可見明顯的Prestin抗體陽性染色。
　　 結(jié)論：通過對本研究結(jié)果的分析，我們認為Prestin分布于外毛細胞膜中最外側(cè)的質(zhì)膜層上，在細胞基底部細胞膜上亦有表達。
　　 第二部分 Prestin蛋白表達的功

7、能性調(diào)控
　　 目的：急性使用水楊酸鈉能夠可逆性的抑制外毛細胞的電運動并引起聽力下降，但長期服用水楊酸鈉可使畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射幅值增大。因Prestin是外毛細胞電運動的動力蛋白，明確長期服用水楊酸鈉對Prestin表達及對外毛細胞電運動有無直接影響，并提示耳蝸放大機制有著重要意義。
　　 方法：本部分中將按照經(jīng)典的耳鳴建模方法，使用水楊酸鈉建立動物模型。在記錄耳聲發(fā)射及外毛細胞電運動的基礎(chǔ)上，結(jié)合實時定量PCR及West

8、ern blot等方法，在RNA、蛋白質(zhì)、細胞以及整體動物等多個水平上，探索Prestin表達與耳蝸功能之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：長期服用水楊酸鈉不僅增大了畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射幅值，也明顯提高了Prestin的表達與外毛細胞電運動能力。在mRNA與蛋白水平，長期服用水楊酸鈉使Prestin蛋白表達量增大至正常水平的3～4倍。外毛細胞電運動直接相關(guān)的充電密度提高了18％。此類變化是可逆性，停止服用水楊酸鈉后Prestin的表達與外毛細

9、胞電運動則恢復(fù)至正常值。本研究從病理生理的角度證明了Prestin對聽覺靈敏度及頻率選擇性的調(diào)控作用。值得注意的是，在這一過程中雖然環(huán)氧合酶(Cox)II的表達不受影響，但是NF-KB的表達被抑制，而核轉(zhuǎn)錄因子c-fos和egr-1的表達則被上調(diào)。
　　 結(jié)論：在體狀態(tài)下長期注射水楊酸鈉后隨著耳蝸功能的增強，Prestin蛋白表達動態(tài)上調(diào)。Cox-II依賴性通路對調(diào)控Prestin表達有重要作用。
　　 第三部分 Pre

10、stin蛋白壓電效應(yīng)提高外毛細胞的高頻響應(yīng)
　　 目的：聽覺換能過程中，哺乳動物活體耳蝸外毛細胞在產(chǎn)生感覺器電位的同時亦承受因基底膜振動所帶來的機械刺激。在外力刺激下，耳蝸外毛細胞基于Prestin產(chǎn)生電運動的同時還具有壓電反應(yīng)，并通過調(diào)控基底膜的行波來有效提高聽覺敏感度與頻率選擇性，這是耳蝸主動放大機制最重要的生理基礎(chǔ)。電壓依賴性的外毛細胞電運動可被跨膜電位驅(qū)動。但通常細胞膜因膜電容的存在而成為一個截止頻率為1kHz左右的低通

11、濾波器，盡管電運動的分子基礎(chǔ)—Prestin蛋白構(gòu)型改變的頻率高達100kHz，但其驅(qū)動力—跨膜電位的高頻部分可被低通濾波器大幅度衰減。根據(jù)機械性牽拉或壓縮外毛細胞能夠引起細胞膜電位變化并有相應(yīng)壓電電流產(chǎn)生的現(xiàn)象，雖推測壓電反應(yīng)可能是其克服高頻衰減的能量來源，但尚缺乏直接地實驗證據(jù)。
　　 方法：將利用全細胞膜片鉗記錄外毛細胞壓電反應(yīng)的方法，在不同條件下給予外毛細胞不同頻率的機械刺激來記錄外毛細胞的壓電反應(yīng)，并通過與模擬電路以及

12、支持細胞高頻響應(yīng)的比較，來驗證Prestin蛋白壓電效應(yīng)是否能夠提高外毛細胞的高頻響應(yīng)。本部分工作將利用全細胞膜片鉗記錄外毛細胞壓電反應(yīng)的方法，在不同條件下給予外毛細胞不同頻率的機械刺激來記錄外毛細胞的壓電反應(yīng)，并通過與模擬電路以及支持細胞高頻響應(yīng)的比較，來驗證Prestin蛋白壓電效應(yīng)是否能夠提高外毛細胞的高頻響應(yīng)。
　　 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)外毛細胞壓電效應(yīng)的存在使得外毛細胞的高頻頻響顯著增大，并將截止頻率擴展至70-90kHz

13、。實驗中采用全細胞膜片鉗可在外毛細胞上記錄到高達80kHz的頻響平臺。當去除壓電效應(yīng)后外毛細胞對單純電刺激的反應(yīng)呈低通特性，截止頻率僅為lkHz左右，這與其它組織細胞相類似。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果證實在耳蝸主動放大機制中外毛細胞電運動可增大高頻響應(yīng)并有效擴展哺乳動物的聽覺頻率范圍。
　　 第四部分耳蝸Deiters細胞及縫隙連接對外毛細胞電運動的調(diào)控
　　 目的：哺乳動物的聽覺器官對聲音具有高靈敏和極精細的分辨

14、能力，以外毛細胞電運動為特征的耳蝸主動放大機制是其重要的基礎(chǔ)。耳蝸外毛細胞處于支持細胞，特別是Deiters細胞(Deiters cell，DC)的支撐和環(huán)繞之中。Deiters細胞細長的指突與外毛細胞頂部的表皮板相連，寬大的胞體與外毛細胞底部相連接構(gòu)成穩(wěn)定的弓形結(jié)構(gòu)以支撐Cortis器的外部形態(tài)。Deiters細胞與外毛細胞之間雖有組織連接，但以往并未觀察到兩者之間存在直接電導聯(lián)的證據(jù)。
　　 方法：利用雙膜片鉗技術(shù)在單離的外

15、毛細胞—Deiters細胞對上，對Deiters細胞及細胞間的縫隙連接通道耦合對外毛細胞電運動影響進行觀察。
　　 結(jié)果：當給予Deiters細胞適當?shù)碾妷夯螂娏鞔碳r能夠直接影響外毛細胞電運動狀態(tài)。Deiters細胞去極化時能夠降低與外毛細胞電運動直接相關(guān)的NLC及頻率響應(yīng)。當Deiters細胞與外毛細胞間的機械耦合或Deiters細胞的細胞骨架被破壞后，Deiters細胞對非線性電容的影響消失。同時我們觀察到Deiters細

16、胞間的縫隙連接(Gap junction，GJ)被破壞后可使膜電位及NLC的電壓依賴特性發(fā)生改變。另外與外毛細胞連接在一起的Deiters細胞可以提高ATP對外毛細胞電運動調(diào)控的效能。
　　 結(jié)論：Deiters細胞能夠通過細胞骨架或改變細胞膜的張力來直接影響外毛細胞的電運動。Deiters細胞間的縫隙連接對外毛細胞狀態(tài)有著直接的調(diào)控作用。上述研究結(jié)果將為我們更深入地理解聽器精細調(diào)控及縫隙連接在內(nèi)耳中的功能提供新的思路。