若干基因調(diào)控信息的檢測(cè)新技術(shù)研究.pdf

1、細(xì)胞水平的信息傳遞和調(diào)控是研究各種細(xì)胞行為的基礎(chǔ)，如細(xì)胞分裂與增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等等。本文進(jìn)行了若干基因調(diào)控信息的檢測(cè)新技術(shù)的研究，提出了幾種研究DNA結(jié)合蛋白以及DNA甲基化定量檢測(cè)的新方法。 一、DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的檢測(cè)新方法 研究許多細(xì)胞調(diào)控功能啟始于DNA結(jié)合蛋白與其相對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)生特異性的結(jié)合，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，DNA復(fù)制，基因的重組，DNA的錯(cuò)配識(shí)別和修復(fù)等等。因此，為了更好的研究細(xì)胞的功能和

2、基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，對(duì)于DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)以及蛋白結(jié)合序列的特征的研究就顯得非常重要。 在本文中，研究并發(fā)展出兩套完整的新型DNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)方法： (1)基于外切核酸酶Ⅲ和SYBR-GreenⅠ染料技術(shù)的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)方法 在此工作中，發(fā)展了一種簡(jiǎn)單的，便宜的，靈敏的檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)序列特異性的DNA結(jié)合蛋白。這項(xiàng)技術(shù)采用了Exonuclease Ⅲ(ExoⅢ)足跡和SYBR GreenⅠ(SG)雙鏈

3、DNA染色的方法來(lái)檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合活性。在這項(xiàng)技術(shù)中，設(shè)計(jì)了與蛋白特異性結(jié)合的雙鏈。DNA探針，此雙鏈探針的一端為蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，另一端具有突出的3’末端(5個(gè)突出的胸腺嘧啶T)，用以阻止ExoⅢ從這個(gè)方向上的酶切。如果存在被檢測(cè)的結(jié)合蛋白，那么該結(jié)合蛋白會(huì)特異性的結(jié)合到雙鏈：DNA探針的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)上，從而通過(guò)物理上的空間位阻作用，阻止ExoⅢ酶的與探針的結(jié)合以及該的切割。這樣被保護(hù)住的探針就可以在SG熒光染料的作用下產(chǎn)生熒光

4、。反之，沒(méi)有結(jié)合蛋白保護(hù)的雙鏈探針將會(huì)被ExoⅢ降解，SG因無(wú)法與DNA探針結(jié)合，則不顯示熒光信號(hào)。在這項(xiàng)工作中，將此檢測(cè)方法成功的應(yīng)用在于核抽提物中檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。同時(shí)通過(guò)這種技術(shù)衡量了NF-κB與不同序列的結(jié)合活性。綜上，將這種方法命名為ExoⅢ-Dye-based assay，這種技術(shù)因其簡(jiǎn)單，廉價(jià)和快速可以被廣泛的應(yīng)用于各種需要檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。 (2)基于實(shí)時(shí)定量PcR技術(shù)的超靈敏DNA結(jié)合蛋白

5、定量檢測(cè)方法 上一項(xiàng)工作中我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)單，廉價(jià)和快速的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)方法。但是該方法具有一些局限，如：只具有普通的檢測(cè)靈敏度(nM級(jí))以及無(wú)法精確的定量檢測(cè)。因此，在進(jìn)一步的工作中，發(fā)展了另一種具有高靈敏度和高定量性的DNA結(jié)合蛋白檢測(cè)技術(shù)。這個(gè)系統(tǒng)是將ExoⅢ足跡和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增技術(shù)完善的結(jié)合起來(lái)，同時(shí)該檢測(cè)過(guò)程不同于Immuno PCR，因?yàn)槠洳恍枰鞍椎奶禺愋钥贵w的參與。在這項(xiàng)技術(shù)中，通過(guò)TailedPCR技術(shù)

6、制作的雙鏈DNA模版序列，既具有蛋白結(jié)合位點(diǎn)(正向序列的5’端)，同時(shí)具有特異性擴(kuò)增的區(qū)域。當(dāng)結(jié)合蛋白存在的時(shí)候，會(huì)結(jié)合到此雙鏈DNA模版上的特定區(qū)域，從而保護(hù)雙鏈DNA的反向序列的3’端不受ExoⅢ的攻擊。進(jìn)而保留下一條完整的單鏈DNA模版序列用于進(jìn)行接著的定量PCR擴(kuò)增。相反，當(dāng)沒(méi)有結(jié)合蛋白保護(hù)的時(shí)候，DNA模版的兩條鏈都會(huì)受到ExoⅢ的降解，從整個(gè)模版都被破壞而無(wú)法被定量PCR擴(kuò)增。此工作中，利用這種檢測(cè)方法，在Hela細(xì)胞核抽提

7、物中檢驗(yàn)了10種不同的轉(zhuǎn)錄因子。其結(jié)果顯示該方法具有良好的穩(wěn)定性和定量效果，且其靈敏度達(dá)到fM級(jí)。由于這項(xiàng)技術(shù)便于使用者自己設(shè)計(jì)和定制所需檢測(cè)蛋白的相應(yīng)探針，并且操作時(shí)間和復(fù)雜度都不高。因此這種高靈敏度和高定量的檢測(cè)新技術(shù)可以被使用到各種科研，醫(yī)療診斷和藥物發(fā)現(xiàn)中去。 二、基于通用TaqMan技術(shù)的DNA甲基化定量檢測(cè)的新方法研究 真核生物體內(nèi)的DNA甲基化屬于一種DNA修飾作用，是重要的轉(zhuǎn)錄水平上的基因調(diào)控方式，在細(xì)胞

8、分化、發(fā)育及增殖過(guò)程中起著十分重要的作用。研究表明，腫瘤細(xì)胞中基因組總體甲基化水平的降低和某些基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生過(guò)甲基化是腫瘤最早，也是最常見(jiàn)的分子改變之一。異常：DNA甲基化通常發(fā)生在CG密集區(qū)，稱之為CpG島，通常位于基因的控制區(qū)及第一外顯子區(qū)。異常DNA甲基化與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活密切相關(guān)，這種現(xiàn)象在腫瘤中非常普遍。因此，異常DNA甲基化的檢測(cè)可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的一個(gè)有用的分子標(biāo)記。近年來(lái)相關(guān)的研究方法發(fā)展迅速，本文旨在描述一

9、種基于通用TaqMan技術(shù)和OMsP技術(shù)的高靈敏、高通量的DNA甲基化分析新分析方法。 該方法結(jié)合：MSP及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，同時(shí)具有MSP的特異性和靈敏性以及實(shí)時(shí)PCR的快速和抗污染等特性，可對(duì)微量DNA的甲基化進(jìn)行精確定量分析。本文中我們?cè)O(shè)計(jì)和應(yīng)用了同時(shí)具有通用序列、甲基化特異性序列和TaqMan結(jié)合區(qū)域的引物，利用Tailed PCR技術(shù)和定量PCR技術(shù)，研究了此通用TaqMan技術(shù)應(yīng)用于QMSP中檢測(cè)的穩(wěn)定性和精確性，