若干基因調(diào)控信息的檢測新技術研究.pdf

1、細胞水平的信息傳遞和調(diào)控是研究各種細胞行為的基礎，如細胞分裂與增殖、細胞分化以及細胞凋亡等等。本文進行了若干基因調(diào)控信息的檢測新技術的研究，提出了幾種研究DNA結(jié)合蛋白以及DNA甲基化定量檢測的新方法。 一、DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的檢測新方法 研究許多細胞調(diào)控功能啟始于DNA結(jié)合蛋白與其相對應的DNA發(fā)生特異性的結(jié)合，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，DNA復制，基因的重組，DNA的錯配識別和修復等等。因此，為了更好的研究細胞的功能和

2、基因表達調(diào)控的機理，對于DNA結(jié)合蛋白的檢測以及蛋白結(jié)合序列的特征的研究就顯得非常重要。 在本文中，研究并發(fā)展出兩套完整的新型DNA結(jié)合蛋白的檢測方法： (1)基于外切核酸酶Ⅲ和SYBR-GreenⅠ染料技術的DNA結(jié)合蛋白檢測方法 在此工作中，發(fā)展了一種簡單的，便宜的，靈敏的檢測技術，用于檢測序列特異性的DNA結(jié)合蛋白。這項技術采用了Exonuclease Ⅲ(ExoⅢ)足跡和SYBR GreenⅠ(SG)雙鏈

3、DNA染色的方法來檢測DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合活性。在這項技術中，設計了與蛋白特異性結(jié)合的雙鏈。DNA探針，此雙鏈探針的一端為蛋白的結(jié)合位點，另一端具有突出的3’末端(5個突出的胸腺嘧啶T)，用以阻止ExoⅢ從這個方向上的酶切。如果存在被檢測的結(jié)合蛋白，那么該結(jié)合蛋白會特異性的結(jié)合到雙鏈：DNA探針的相應結(jié)合位點上，從而通過物理上的空間位阻作用，阻止ExoⅢ酶的與探針的結(jié)合以及該的切割。這樣被保護住的探針就可以在SG熒光染料的作用下產(chǎn)生熒光

4、。反之，沒有結(jié)合蛋白保護的雙鏈探針將會被ExoⅢ降解，SG因無法與DNA探針結(jié)合，則不顯示熒光信號。在這項工作中，將此檢測方法成功的應用在于核抽提物中檢測轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。同時通過這種技術衡量了NF-κB與不同序列的結(jié)合活性。綜上，將這種方法命名為ExoⅢ-Dye-based assay，這種技術因其簡單，廉價和快速可以被廣泛的應用于各種需要檢測DNA結(jié)合蛋白的生物醫(yī)學領域。 (2)基于實時定量PcR技術的超靈敏DNA結(jié)合蛋白

5、定量檢測方法 上一項工作中我們發(fā)展了一種簡單，廉價和快速的DNA結(jié)合蛋白檢測方法。但是該方法具有一些局限，如：只具有普通的檢測靈敏度(nM級)以及無法精確的定量檢測。因此，在進一步的工作中，發(fā)展了另一種具有高靈敏度和高定量性的DNA結(jié)合蛋白檢測技術。這個系統(tǒng)是將ExoⅢ足跡和實時定量PCR擴增技術完善的結(jié)合起來，同時該檢測過程不同于Immuno PCR，因為其不需要蛋白的特異性抗體的參與。在這項技術中，通過TailedPCR技術

6、制作的雙鏈DNA模版序列，既具有蛋白結(jié)合位點(正向序列的5’端)，同時具有特異性擴增的區(qū)域。當結(jié)合蛋白存在的時候，會結(jié)合到此雙鏈DNA模版上的特定區(qū)域，從而保護雙鏈DNA的反向序列的3’端不受ExoⅢ的攻擊。進而保留下一條完整的單鏈DNA模版序列用于進行接著的定量PCR擴增。相反，當沒有結(jié)合蛋白保護的時候，DNA模版的兩條鏈都會受到ExoⅢ的降解，從整個模版都被破壞而無法被定量PCR擴增。此工作中，利用這種檢測方法，在Hela細胞核抽提

7、物中檢驗了10種不同的轉(zhuǎn)錄因子。其結(jié)果顯示該方法具有良好的穩(wěn)定性和定量效果，且其靈敏度達到fM級。由于這項技術便于使用者自己設計和定制所需檢測蛋白的相應探針，并且操作時間和復雜度都不高。因此這種高靈敏度和高定量的檢測新技術可以被使用到各種科研，醫(yī)療診斷和藥物發(fā)現(xiàn)中去。 二、基于通用TaqMan技術的DNA甲基化定量檢測的新方法研究 真核生物體內(nèi)的DNA甲基化屬于一種DNA修飾作用，是重要的轉(zhuǎn)錄水平上的基因調(diào)控方式，在細胞

8、分化、發(fā)育及增殖過程中起著十分重要的作用。研究表明，腫瘤細胞中基因組總體甲基化水平的降低和某些基因啟動子區(qū)發(fā)生過甲基化是腫瘤最早，也是最常見的分子改變之一。異常：DNA甲基化通常發(fā)生在CG密集區(qū)，稱之為CpG島，通常位于基因的控制區(qū)及第一外顯子區(qū)。異常DNA甲基化與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活密切相關，這種現(xiàn)象在腫瘤中非常普遍。因此，異常DNA甲基化的檢測可以作為腫瘤診斷和預后的一個有用的分子標記。近年來相關的研究方法發(fā)展迅速，本文旨在描述一

9、種基于通用TaqMan技術和OMsP技術的高靈敏、高通量的DNA甲基化分析新分析方法。 該方法結(jié)合：MSP及實時定量PCR技術，同時具有MSP的特異性和靈敏性以及實時PCR的快速和抗污染等特性，可對微量DNA的甲基化進行精確定量分析。本文中我們設計和應用了同時具有通用序列、甲基化特異性序列和TaqMan結(jié)合區(qū)域的引物，利用Tailed PCR技術和定量PCR技術，研究了此通用TaqMan技術應用于QMSP中檢測的穩(wěn)定性和精確性，