高強(qiáng)度聚焦超聲逆轉(zhuǎn)K562-AO2細(xì)胞多藥耐藥的實(shí)驗研究.pdf

1、背景：腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，是目前腫瘤化療失敗的一個主要原因。耐藥腫瘤細(xì)胞大多有P-gp(P-glycoprotein，P170 糖蛋白)蛋白的高表達(dá)，作為具有外排泵功能的P-gp蛋白能夠能量依賴性地排出包括化療藥物在內(nèi)的多種底物，對于細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)行為也有一定的影響，研究 MDR的發(fā)生機(jī)制和有效的逆轉(zhuǎn)MDR已成為腫瘤治療急需解決的問題。傳統(tǒng)的 MDR 逆轉(zhuǎn)以抑制 P-g

2、p 的藥物為主，但是藥物性MDR逆轉(zhuǎn)劑的效率較低，而且毒副作用較大，臨床應(yīng)用難以達(dá)到有效的逆轉(zhuǎn)濃度。因此，尋找一種高效、低毒逆轉(zhuǎn)MDR的方法是十分必要的。 目的：研究高強(qiáng)度聚焦超聲 (High intensity focused ultrasound -HIFU) 逆轉(zhuǎn)K562/AO2 細(xì)胞MDR的效能，并與傳統(tǒng)的MDR逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米(VRP)比較，初步探討其逆轉(zhuǎn)MDR作用機(jī)制，從而為克服腫瘤細(xì)胞MDR提供一種新的、有效的方法和

3、思路。 方法：①超聲劑量學(xué)研究：固定超聲輻照時間或超聲聲強(qiáng)，應(yīng)用不同聲強(qiáng)或輻照時間的HIFU輻照K562、K562/AO2 細(xì)胞株后，應(yīng)用熒光顯微鏡 Annexin V/PI 染色檢測細(xì)胞的即刻以及48h凋亡情況，用臺盼藍(lán)、MTT 法檢測HIFU對腫瘤細(xì)胞的抑制率，了解 HIFU 劑量-效應(yīng)關(guān)系。②將對數(shù)生長期的K562、K562/AO<,2>細(xì)胞株分組為：阿霉素 (ADM)組、ADM 加 HIFU 輻照(劑量為 400W/cm

4、<'2>×5s)組(HIFU組)、ADM 加維拉帕米組(VRP組)。各組分別用 MTT 法檢測 K562、K562/AO<,2>細(xì)胞各組的抑制率，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測各組細(xì)胞內(nèi)的ADM濃度，PI染色觀察DNA含量的變化，用 FCM 和熒光顯微鏡 Annexin V/PI 染色檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。③免疫組化檢測各組P-gp、PDCD5表達(dá)情況，并用 Image-Pro Plus5.02 軟件定量分析。 結(jié)果：①當(dāng)輻照時間

5、一定時(5s)聲強(qiáng)越高腫瘤細(xì)胞存活率越低，當(dāng)HIFU聲強(qiáng)一定時(400 W/cm<'2>)細(xì)胞存活率隨 HIFU 輻照時間延長而下降，HIFU 輻照劑量為400W/ cm<'2>×5s 時對 K562、K562/AO2 細(xì)胞的存活不產(chǎn)生明顯影響，未觀察到即刻和延遲的凋亡現(xiàn)象；②在K562細(xì)胞株中 HIFU、VRP 對細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度沒有明顯影響，腫瘤細(xì)胞增值抑制率和凋亡率HIFU 組、VRP組、ADM組各組之間比較P均>0.05。在

6、 K562/AO2 細(xì)胞株中HIFU、VRP 均能提高 K562/AO2 細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度，HIFU 組、VRP 組與 ADM 組比較P均<0.01，HIFU 組與 VRP組比較差異無顯著性(P>0.05)。HIFU 組、VRP組、ADM 組均能抑制 K562/AO2 細(xì)胞的增殖，HIFU 組、VRP組與ADM 組比較P均 <0.01，HIFU 組與VRP組比較差異無顯著性(P>0.05)。HIFU組、VRP 組、ADM組均能使K5

7、62/AO2細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞周期分析S期細(xì)胞比例(SPF) 降低，降低幅度HIFU組、VRP組高于ADM組(P均<0.05)，HIFU 組與VRP組比較差異無顯著性(P>0.05)。③免疫組化的Image-pro plus 分析發(fā)現(xiàn)：P-gp在K562/AO2 表達(dá)明顯高于K562，HIFU 輻照 K562/AO2 細(xì)胞后 P-gp 表達(dá)明顯降低。PDCD5 在 K562/AO2 表達(dá)明顯低于K562，HIFU 輻照后K562/AO2

8、 細(xì)胞PDCD5 表達(dá)升高。 結(jié)論：一定強(qiáng)度劑量的HIFU輻照耐藥的腫瘤細(xì)胞可以提高化療藥物在耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，同時可以增強(qiáng)化療藥物對耐藥腫瘤細(xì)胞的增值抑制率和凋亡率。HIFU 逆轉(zhuǎn) MDR的可能機(jī)理是增加了生物膜對于化療藥物的通透性、下調(diào)耐藥細(xì)胞的 P-gp表達(dá)和上調(diào)PDCD5表達(dá)，從而改變了耐藥腫瘤細(xì)胞的凋亡耐受狀態(tài)，提高了耐藥腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒藥物的敏感性，一定程度上逆轉(zhuǎn)了MDR。雖然在效能比較上HIFU 與 VRP差異