胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段血清蛋白質(zhì)指紋圖譜及意義研究.pdf

1、我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率占所有惡性腫瘤中的比率在農(nóng)村為第一位，在城市為第二位，每年約有20萬(wàn)人死于胃癌。目前依靠胃鏡檢查是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的有效手段，但胃鏡檢查存在諸多不便。尋找一種簡(jiǎn)單易行、靈敏度高、特異性強(qiáng)的早期胃癌診斷方法是當(dāng)務(wù)之急。胃癌器官轉(zhuǎn)移率國(guó)內(nèi)報(bào)道為64.2％，其中男性以肝轉(zhuǎn)移最多38.1％，女性則以卵巢轉(zhuǎn)移多見(jiàn)43.6％。臨床診斷肝轉(zhuǎn)移的胃癌病例平均生存期僅為5.5個(gè)月；臨床診斷卵巢轉(zhuǎn)移的胃癌病例66％生存期僅為半年。因此，如

2、何解決胃癌肝轉(zhuǎn)移、卵巢轉(zhuǎn)移早期診斷和防治的難題。 表面增強(qiáng)激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF)技術(shù)是新發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)。根據(jù)定位于芯片表面物質(zhì)的性質(zhì)不同，可將所用芯片分為化學(xué)型芯片和生物型芯片。近兩年來(lái)，該技術(shù)在差異蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)分子相互作用、疾病診斷等方面得到了廣泛應(yīng)用，為差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)。 (一)臨床病例資料及血清標(biāo)本收集： 1.臨床病例資料：收集2004-2

3、005年診斷證實(shí)的胃癌患者57例，男：女39：18；年齡42-84歲，平均年齡60±15.3歲；組織學(xué)分型及分化程度(34例)：高分化腺癌7例；中分化腺癌10例；低分化腺癌11例；印戒細(xì)胞癌6例。臨床病理分期:早期胃癌19例，進(jìn)展期38例。將本組病例分為3組：早期胃癌組(19例)、不伴臟器轉(zhuǎn)移之進(jìn)展期胃癌組(25例)、伴臟器轉(zhuǎn)移之進(jìn)展期胃癌組(12例)。解放軍306醫(yī)院提供除胃以外的消化道癌肝轉(zhuǎn)移患者9例，用于與本組胃癌肝轉(zhuǎn)移做比較分析

4、。收集沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)胃鏡活檢及病理確診的胃良性病患者7例，其中不典型增生2例，慢性萎縮性胃炎2例，胃息肉1例，胃潰瘍2例。解放軍306醫(yī)院提供健康者30例。 2.血清標(biāo)本收集：采集患者接收治療前早晨空腹靜脈血，靜置凝結(jié)，于2500rpm離心5min，分裝血清，凍存于-70℃冰箱中備用。 (二)儀器、材料及蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)方法 1.儀器、芯片及主要試劑：表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(

5、SELDI-TOF，美國(guó)Ciphergen公司)，化學(xué)修飾的WCX2芯片。所用尿素、乙腈、三氟乙酸、Tris-HCI pH9.0、CHAPS、DTT、NaAc、HPLC H2O、Hepes等均購(gòu)自Sigma公司。 2.血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)方法：血清樣品前處理：取3μl血清加6μlU9處理液(pH9.0)，充分混勻，冰浴振蕩30min，加入108μl結(jié)合緩沖液(100mmol/LNaAc,pH4.0)，立即混勻。上樣及洗脫：將WCX

6、2芯片裝入bioprocessor中，每孔加入200μl結(jié)合緩沖液，室‘溫振蕩洗滌2次，5min/次，甩干。每孔分別加入100μl樣品混合液，振蕩孵育1h，甩去樣品，用200μl洗脫緩沖液(100mmol/LNaAc，pH4.0)室溫振蕩洗滌2次，5min/次，甩干；再用HPLC H2O洗滌1次，立即甩干。拆開(kāi)bioproceessor，取出芯片，晾干后，每點(diǎn)加2次0.5μl SPA，晾干后上機(jī)檢測(cè)。 3.數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

7、采用蛋白飛行質(zhì)譜儀(PBSH-C型)對(duì)結(jié)合在WCX2芯片上的血清蛋白進(jìn)行讀取分析，設(shè)定最高檢測(cè)分子量為50kD，優(yōu)化范圍為2kD-20kD，激光強(qiáng)度190，檢測(cè)敏感度為8，將1kD以下的峰濾去。采用Ciphergen Proteinchip3.1版本的分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，用質(zhì)譜峰下面積表示蛋白質(zhì)豐度。采用Biomarker Wizard軟件分析蛋白質(zhì)指紋圖譜，確定兩組間蛋白峰值的差異。在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)時(shí)，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義。 (三)早期胃癌樹(shù)狀分類模型建立及盲篩評(píng)估方法： 1.早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型初步建立 1.1參與訓(xùn)練、建模的病例資料：在本組病例中隨機(jī)挑選30例胃癌患者(早期10例、進(jìn)展期中不伴臟器轉(zhuǎn)移14例、伴遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移6例)及30例正常對(duì)照作為訓(xùn)練組參加建模。 1.2早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型建立方法與主要步驟： 建模方法：采用Ciphergen公司Biomarker Patterns So

9、ftware初步建立早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型。建模中采用Cini分布索引方法形成CART決策樹(shù)(分類和回歸樹(shù))，同時(shí)選用決策樹(shù)袋法，以克服向前可變選擇過(guò)程中(如決策樹(shù))的不穩(wěn)定性，并提高總體分類性能。 建模主要步驟：選擇篩選的早期胃癌與正常對(duì)照組之間的49個(gè)差異蛋白質(zhì)峰信號(hào)簇構(gòu)成決策樹(shù)，按49個(gè)質(zhì)點(diǎn)的高維特征將其劃分為小的矩形，并將每個(gè)矩形劃分為“癌”、“非癌”。以30例胃癌、30例正常對(duì)照作為訓(xùn)練組，以其差異蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度

10、為基礎(chǔ)進(jìn)行學(xué)習(xí)訓(xùn)練，確定判斷癌與非癌的蛋白質(zhì)豐度閾值(界值)。按照49個(gè)差異蛋白質(zhì)在訓(xùn)練組中癌與非癌鑒別過(guò)程中的權(quán)重打分并排序，按權(quán)重排序原則首先選用單一蛋白質(zhì)，然后再試用多個(gè)蛋白質(zhì)相互組合進(jìn)行樹(shù)狀分類器模型構(gòu)建。通過(guò)學(xué)習(xí)和自我訓(xùn)練，以能達(dá)到對(duì)訓(xùn)練組標(biāo)本最佳分類的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組合作為初步構(gòu)建的早期胃癌預(yù)警樹(shù)狀分類器模型。 2.采用盲篩實(shí)驗(yàn)評(píng)估早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型 2.1 參與盲篩實(shí)驗(yàn)的病例資料：本組病例中未參加

11、建模的27例胃癌患者、7例良性患者及19例健康對(duì)照。 2.2盲篩實(shí)驗(yàn)方法：采用蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜分析儀配置的Biomarker Patterns軟件初步建立早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型。分別用上述建立的樹(shù)狀分類模型對(duì)盲篩組標(biāo)本蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)做出相應(yīng)的“癌”與“非癌”的判定，判定結(jié)果與標(biāo)本實(shí)際病理診斷相符為判別正確，否則為錯(cuò)誤。 2.3 對(duì)初步建立的早期胃癌預(yù)警決策樹(shù)分類器模型進(jìn)行評(píng)估：根據(jù)盲篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用敏感性、特異性

12、、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、總有效率等指標(biāo)對(duì)模型分類效果進(jìn)行評(píng)估。 結(jié)果: 1.健康者、胃良性病變及早期胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化胃良性病變與健康者相比較其差異蛋白質(zhì)達(dá)26種之多，但與早期胃癌患者間的差異蛋白質(zhì)僅6種，早期胃癌與健康對(duì)照差異蛋白質(zhì)數(shù)量達(dá)42種，其中27種蛋白質(zhì)在早期胃癌中低表達(dá)，15種在早期胃癌中高表達(dá)。 2.不同分化程度胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化發(fā)現(xiàn)高、低分化胃癌血清蛋白質(zhì)譜有不同特征，其

13、中M/Z為2091、2197、2281等蛋白在低分化胃癌組呈高表達(dá)，而M/z為34927蛋白在高分化胃癌組呈高表達(dá)。 3.不同臨床病理分期胃癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜變化進(jìn)展期與早期胃癌組之間檢出19種顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)；伴臟器轉(zhuǎn)移組與導(dǎo)期胃癌組之間檢出13種顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)；進(jìn)展期胃癌中，伴臟器轉(zhuǎn)移組與不伴臟器轉(zhuǎn)移組之間檢出7種顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 4.胃癌肝轉(zhuǎn)移與其它消化道癌肝轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)指紋圖譜變化在9例胃癌肝轉(zhuǎn)移與

14、9例其它消化道癌肝轉(zhuǎn)移患者的血清差異蛋白質(zhì)指紋圖譜比對(duì)分析中，共獲得16種差異蛋白質(zhì)峰譜，其中9種差異蛋白質(zhì)在胃癌肝轉(zhuǎn)移組顯著高于其它消化道癌肝轉(zhuǎn)移組，更有意義的是，與非胃消化道癌肝轉(zhuǎn)移組相比，胃癌肝轉(zhuǎn)移組顯著差異表達(dá)的4887、6196、10260、9288 M/Z四種蛋白質(zhì)與正常對(duì)照組比較也有顯著性差異。 5.早期胃癌決策樹(shù)分類器模型構(gòu)建與盲篩驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)共建立3個(gè)早期胃癌決策樹(shù)分類器模型。 摸型I由6196 M/Z單

15、一蛋白質(zhì)構(gòu)成，用模型Ⅰ對(duì)未參加建模的27例胃診斷正確率為42.9％(3/7)，有4例被誤判為胃癌。 模型Ⅱ主要由6366 M/Z蛋白質(zhì)構(gòu)成，用模型Ⅱ?qū)ξ磪⒓咏５?7例胃癌、7例胃良性病患者及19例健康者進(jìn)行識(shí)別試驗(yàn)(盲篩)，結(jié)果27例胃癌診斷正確率為96.3％(26/27)，僅有Ⅰ例被誤判為非癌；19例健康者診斷正確率為100％(19/19)；7例胃良性病變?cè)\斷正確率為42.9％(3/7)，有4例被誤判為胃癌。 模型Ⅲ

16、主要由M/Z為13738，8931，2048三種差異蛋白質(zhì)構(gòu)成。用模型Ⅲ對(duì)盲篩組患者盲篩，結(jié)果27例胃癌診斷正確率為96.3％(26/27)，僅有1例被誤判為非癌；19例健康者診斷正確率為94.7％(18/19)，有1例被誤判為胃癌；7例胃良性病變?cè)\斷正確率為14.3％(1/7)，有6例被篩為胃癌。 結(jié)論： 1.與健康對(duì)照組相比較，早期胃癌組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜有顯著差異，提示血清蛋白質(zhì)指紋圖譜對(duì)早期胃癌預(yù)警可能有潛在的應(yīng)

17、用前景。本研究初步篩出6366、6196M/Z等幾種在早期胃癌患者血清中低表達(dá)的蛋白質(zhì)，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，有可能成為新的早期胃癌預(yù)警分子。 2.不同分化程度的胃癌具有不同的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜，其中低分化胃癌組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜與其它分化程度胃癌組相比差異顯著，提示低分化胃癌涉及的基因及蛋白表達(dá)異?？赡芨鼮閺?fù)雜。 3.本實(shí)驗(yàn)共獲得16種胃癌肝轉(zhuǎn)移與其它消化道癌肝轉(zhuǎn)移血清差異蛋白，其中6196、4887、10260、928