丹參對(duì)阻塞性黃疸大鼠肝臟、腎臟細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、阻塞性黃疸(OJ)是臨床上常見并發(fā)癥，膽道系統(tǒng)的良、惡性梗阻、手術(shù)損傷等均可導(dǎo)致OJ并隨即出現(xiàn)嚴(yán)重的多臟器損傷。目前認(rèn)為阻塞性黃疸(OJ)可誘導(dǎo)肝臟、脾臟、淋巴細(xì)胞、胃腸黏膜以及心臟血流動(dòng)力學(xué)障礙等功能損害。但是，OJ時(shí)引起多臟器損害的內(nèi)在機(jī)制還不清楚。普遍認(rèn)為，內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)、以及膽汁酸升高誘發(fā)OJ時(shí)肝或其他器官損傷。此外，高膽管內(nèi)壓力和門靜脈壓力，也是造成這一傷害的重要因素。近年來(lái)隨著細(xì)胞凋亡研究的深入，已發(fā)現(xiàn)許多肝膽系統(tǒng)疾病與細(xì)

2、胞凋亡規(guī)律失常有關(guān)，細(xì)胞凋亡在維持肝膽系統(tǒng)正常生理狀態(tài)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著十分重要的作用。研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡參與OJ多臟器功能損傷的發(fā)病機(jī)制有兩種：一是受基因調(diào)控，另一種是受非基因調(diào)控；基因調(diào)控又分為直接調(diào)控和間接調(diào)控，前者包括p53、Bax、Fas-Fasl、Bcl-2等，后者如TGF、TNF、NF-1B等。其中，Bax是一種可溶性蛋白質(zhì)，正常情況下以單體形式定位于細(xì)胞漿，當(dāng)收到凋亡刺激時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體并與線粒體外膜結(jié)

3、合，直接降低線粒體外膜穩(wěn)定性或與Bcl-2結(jié)合成異源二聚體的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。NF-kB是一種廣泛存在于多種細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的具有細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子，是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白R(shí)el家族成員之一，參與多種炎性因子基因表達(dá)的調(diào)控及細(xì)胞凋亡等多種病理生理過(guò)程。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞處于氧自由基水平升高、缺血-再灌注損傷、內(nèi)毒素血癥等應(yīng)激狀態(tài)下，I-kB可使NF-kB活化易位進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合于靶基因特異的啟動(dòng)子區(qū)域的KB基因序列結(jié)合，從而啟動(dòng)

4、促炎癥分子基因的轉(zhuǎn)錄核蛋白質(zhì)的合成，引起TNF-α、IL-6mRNA等的強(qiáng)烈表達(dá)，產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，同時(shí)間接促使凋亡細(xì)胞增加，加速對(duì)臟器細(xì)胞的毒性作用并最終出現(xiàn)多器官功能損傷。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bax蛋白、NF-kB蛋白明顯高表達(dá)時(shí)，梗阻性黃疸大鼠肝腎組織細(xì)胞凋亡明顯增多?，F(xiàn)今研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB亞單位的種類及數(shù)量在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用，當(dāng)c-RelA亞型表達(dá)增加時(shí)，則促進(jìn)凋亡的發(fā)生。藥物治療OJ多臟器功能損害能否通過(guò)調(diào)控臟器細(xì)胞凋

5、亡從而獲得療效正引起研究者的興趣。丹參是一種傳統(tǒng)中藥，通常用于活血治療。丹參是野生丹參根的提取物，主要活性成分包括丹參素，丹酚酸以及丹參酮等，能夠起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)抗炎癥，防止脂質(zhì)過(guò)氧化和鈣超載的作用。研究表明，丹參治療OJ大鼠時(shí)通過(guò)降低內(nèi)毒素水平、減少炎癥介質(zhì)等已經(jīng)得到普遍認(rèn)同的機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞，維護(hù)肝功能，以及減少對(duì)腎皮質(zhì)和腎功能損害的作用。但是丹參是否通過(guò)抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制起到治療作用，尚無(wú)進(jìn)一步研究。
　　 目的

6、：通過(guò)觀察丹參對(duì)阻塞性黃疸大鼠(OJ)肝臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞凋亡和Bax、NF-kB蛋白表達(dá)的影響，探討丹參對(duì)肝臟、腎臟的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：①取雄性清潔級(jí)健康SD大鼠180只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(體重270～330g)。購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2007-0003]。大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前

7、禁食12 h，自由飲水。②將大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(n=60)、模型組(n=60)、丹參治療組(n=60)。假手術(shù)組僅游離大鼠膽總管而不結(jié)扎，然后分層關(guān)腹。模型組和丹參治療組游離大鼠膽總管后用絲線雙重結(jié)扎膽總管近端，并切斷膽總管，分層關(guān)腹。丹參治療組組按每只0.2ml/100g/d腹腔內(nèi)注射丹參注射液，而假手術(shù)組、模型組每日注射等量的生理鹽水。按術(shù)后不同時(shí)間段各組分為OJ7d、14d、21d、28d組(n=15)。③記錄術(shù)后各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)大

8、鼠的一般情況，包括大鼠活動(dòng)度、精神狀況、大小便顏色及是否改變、眼白及皮毛染色有無(wú)改變，死亡率等。④檢測(cè)各組、各時(shí)間點(diǎn)血清TBIL、DBIL、γ-GT，BUN、CREA含量，通過(guò)對(duì)大體標(biāo)本肉眼觀察、光鏡法及電鏡法觀察各組、各時(shí)間點(diǎn)肝臟、腎臟組織病理改變特征，判斷大鼠阻塞性黃疸模型建立是否成功，以及運(yùn)用丹參治療后與模型組一般情況、血清指標(biāo)、病理變化來(lái)判斷治療效果。⑤運(yùn)用組織芯片技術(shù)制作肝、腎組織微陣列切片。采用組織微陣列片制作機(jī)(Beech

9、er Instruments，USA)制備肝、腎的組織微陣列片，將100個(gè)直徑2毫米的小組織樣本，以陣列方式包埋于同一塊20mm×45 mm的石蠟塊中，再進(jìn)行切片，用于同一實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的研究。⑥在制作完成的肝腎組織微陣列切片上通過(guò)DNA缺口原位末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)。在微陣列切片上進(jìn)行TUNEL染色，高倍鏡下(400倍)觀察凋亡細(xì)胞的分布。每張切片隨機(jī)選擇5-10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，用百分?jǐn)?shù)表

10、示，計(jì)算凋亡指數(shù)( AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％。本部分工作在陜西超英生物科技有限公司完成。⑦在制作完成的肝腎組織微陣列切片上通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織切片中Bax、NF-kB c-RelA蛋白表達(dá)水平。在微陣列切片上采用二步EnVision法，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1)接著色細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分為：細(xì)胞呈陰性染色為-；染色弱，陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色為+；染色中等，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色為++；染色強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色為++。2)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(面積)：

11、無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為-；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25％為+；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25～50％為++；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50％為++。
　　 結(jié)果：⑴假手術(shù)組21d死亡1只，其余時(shí)間點(diǎn)無(wú)死亡；模型組7d死亡2只，14d死亡4只，21d死亡4只，28d死亡7只；丹參治療組7d無(wú)死亡，14d死亡3只，21d死亡2只，28d死亡4只。7d三組間死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，14d、21d假手術(shù)組與模型組間死亡率均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)，28d假手術(shù)組與模型組間死亡率存在

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.006)，假手術(shù)組與治療組間死亡率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.032)。⑵各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組TBIL、DBIL、γ-GT和CREA含量明顯小于模型組與治療組(P<0.01)；OJ21、28d治療組大鼠血清TBIL、CREA含量均明顯低于模型組( P<0.050r P<0.01)；OJ28d治療組大鼠血清DBIL含量均明顯低于模型組(P<0.01)，OJ21d治療組大鼠血清γ-GT含量均明顯低于模型組(P<0.01)。⑶大體

13、、光鏡及電鏡觀察下，OJ丹參治療組大鼠的肝臟、腎臟病理改變較模型組均不同程度地減輕。⑷肝臟凋亡指數(shù)在21d丹參治療組明顯低于模型組(P<0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)各組間無(wú)顯著性差異。腎臟凋亡指數(shù)14d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)丹參治療組與假手術(shù)組無(wú)明顯差異(P>0.05)，14d丹參治療組明顯小于模型組(P<0.01)。⑸肝臟Bax蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度以及陽(yáng)性強(qiáng)度和面積的乘積在各時(shí)間點(diǎn)模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，

14、7，21，28天時(shí)間點(diǎn)丹參治療組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)丹參治療組與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。肝臟NF-kB c-RelA蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度以及陽(yáng)性強(qiáng)度和面積的乘積在7d、14d、21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)丹參治療組與假手術(shù)組、模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。腎臟Bax蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)丹參治療組與假手術(shù)組、模型組無(wú)明顯差異(P>0.0

15、5)。腎臟Bax蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度和面積乘積21d模型組明顯大于假手術(shù)組(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)丹參治療組與假手術(shù)組無(wú)明顯差異(P>0.05)，21d丹參治療組明顯小于模型組(P<0.01)。腎臟NF-kB c-RelA蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度以及陽(yáng)性強(qiáng)度和面積的乘積在各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組與模型組、丹參治療組以及模型組與丹參治療組之間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：①結(jié)扎大鼠膽總管后，模型組及丹參治療組大鼠血清TBIL、DBIL及γ-G

16、T濃度均較未結(jié)扎膽總管的假手術(shù)組明顯升高，且血清膽紅素以DBIL為主；同時(shí)模型組及丹參治療組大鼠血清BUN、CREA濃度也均較假手術(shù)組明顯升高，且肝腎組織有顯著的病理?yè)p傷表現(xiàn)，說(shuō)明阻塞性黃疸在肝功能受損同時(shí)也可導(dǎo)致腎功能損傷。②阻塞性黃疸大鼠可出現(xiàn)肝、腎組織Bax蛋白、肝臟NF-kB c-RelA蛋白表達(dá)明顯升高，肝、腎組織凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯增加。③丹參能明顯地降低OJ大鼠血清TBIL、DBIL、γ-GT及CREA含量，減少肝腎細(xì)胞凋亡數(shù)