人TFPI基因轉(zhuǎn)移對搭橋模型移植靜脈血栓形成和內(nèi)膜增生的影響.pdf

1、實驗一、真核表達載體pCMV-(Kozak)TFPI的構(gòu)建及鑒定。 目的：構(gòu)建并鑒定真核表達載體pCMV-(Kozak)TFPI，為下一步轉(zhuǎn)染靜脈血管內(nèi)皮細胞抗再狹窄研究奠定基礎(chǔ)。 方法：用RT-PCR的方法提取全長人組織因子途徑抑制因子（TFPI）基因，引入Kozak序列和亞克隆位點，將(Kozak)TFPI序列連入T載體中測序。然后將(Kozak)TFPI序列亞克隆入pCMV質(zhì)粒中，酶切鑒定。 結(jié)果：測序獲得

2、的全長人TFPI基因序列與GeneBank中該序列完全一致，Kozak序列成功加入。酶切鑒定(Kozak)TFPI序列成功克隆入pCMV中。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pCMV-(Kozak)TFPI真核表達載體。 實驗二、外源TFPI基因mRNA和蛋白在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中表達的檢測。 目的：檢測真核表達載體pCMV-(Kozak)TFPI在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中的表達效果，以評價該載體的表達能力。 方法

3、：將長有HUVEC的4個6孔培養(yǎng)板中24孔平均分為2組，即TFPI轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組，每組12孔。TFPI轉(zhuǎn)染組在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下，用pCMV-(Kozak)TFPI轉(zhuǎn)染HUVEC，而空載體轉(zhuǎn)染組則以空載體pCMV代替pCMV-(Kozak)TFPI轉(zhuǎn)染HUVEC，其余條件均相同。轉(zhuǎn)染24h后，以RT-PCR、免疫熒光和Western blot法檢測HUVEC 中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表達，并根據(jù)免疫熒光結(jié)果計算外源TFP

4、I基因的轉(zhuǎn)染率。 結(jié)果：RT-PCR、免疫熒光和Western blot檢測到TFPI轉(zhuǎn)染組中外源TFPI基因mRNA和蛋白的表達。外源TFPI基因的轉(zhuǎn)染率為23％。 結(jié)論：真核表達載體pCMV-(Kozak)TFPI在轉(zhuǎn)染的HUVEC中成功的表達出了外源TFPI mRNA和蛋白。 實驗三、人TFPI基因轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈血栓形成和近期通暢率的影響。 目的：為減少冠狀動脈旁路移植術(shù)后血栓形成，探討人TFPI

5、基因轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈血栓生成的影響。 方法：將60只日本大耳白兔隨機分為3組，每組20只，即TFPI轉(zhuǎn)染組、空載體對照組和空白對照組。建立頸總動脈旁路移植模型，吻合前，TFPI轉(zhuǎn)染組采用陽離子脂質(zhì)體pCMV-(Kozak)TFPI（400μg）和腔內(nèi)加壓灌注法（30min）轉(zhuǎn)染移植靜脈內(nèi)皮細胞，空載體對照組以空質(zhì)粒pCMV（400μg）代替pCMV-(Kozak)TFPI，而空白對照組靜脈內(nèi)皮不予干預(yù)。術(shù)后3d，用RT-PCR、

6、Westernblot和免疫組織化學(xué)法檢測外源基因在移植靜脈中的表達，病理標(biāo)本、掃描電鏡觀察移植靜脈血栓形成情況。術(shù)后30d，血管多普勒觀測其通暢率。 結(jié)果：術(shù)后3d，TFPI轉(zhuǎn)染組移植靜脈中有人TFPI基因mRNA和蛋白表達。TFPI轉(zhuǎn)染組、空載體和空白對照組分別有1條、8條和7條移植靜脈發(fā)生血栓；術(shù)后30d，以上各組分別有0條、5條和5條移植靜脈完全閉塞，前者靜脈血栓發(fā)生率低于后兩者（P<0.05），而靜脈通暢率高于后兩者（

7、P<0.05）。術(shù)后3d，掃描電鏡顯示兩對照組內(nèi)皮表面有紅細胞和血小板黏附、聚集，而TFPI轉(zhuǎn)染組基本正常。 結(jié)論：人TFPI基因干預(yù)，減少了兔移植靜脈血栓形成，提高了近期通暢率。 實驗四、人TFPI基因轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈新生內(nèi)膜的影響。 目的：為減少冠狀動脈旁路移植術(shù)后移植靜脈再狹窄，探討人TFPI基因轉(zhuǎn)染對兔移植靜脈內(nèi)膜增生的影響。 方法：將60只日本大耳白兔隨機分為3組，每組20只，即TFPI轉(zhuǎn)染組、

8、空載體對照組和空白對照組。建立頸總動脈旁路移植模型，吻合前，TFPI轉(zhuǎn)染組采用陽離子脂質(zhì)體pCMV-(Kozak)TFPI（400μg）和腔內(nèi)加壓灌注法（30min）轉(zhuǎn)染移植靜脈內(nèi)皮細胞，空載體對照組以空質(zhì)粒pCMV（400μg）代替pCMV-(Kozak)TFPI，而空白對照組靜脈內(nèi)皮不予干預(yù)。術(shù)后3d，用RT-PCR、Westernblot和免疫組織化學(xué)法檢測外源基因在移植靜脈中的表達。術(shù)后30d，血管多普勒測量移植靜脈管腔內(nèi)徑和管

9、壁厚度。組織病理標(biāo)本測量內(nèi)膜面積（I）和中膜面積（M）并計算（I/M）。透射電鏡觀察移植靜脈新生內(nèi)膜的細胞構(gòu)成。 結(jié)果：術(shù)后3d，TFPI轉(zhuǎn)染組移植靜脈中有人TFPI基因mRNA和蛋白表達。術(shù)后30d，TFPI轉(zhuǎn)染組移植靜脈管腔內(nèi)徑為（2.68±0.32）mm，大于空載體對照組（2.41±0.23）mm和空白對照組（2.38±0.21）mm（P<0.05）。TFPI轉(zhuǎn)染組管壁厚度為（1.09±0.11）mm，小于空載體對照組（1

10、.28±0.16）mm和空白對照組（1.34±0.14）mm（P<0.01）。TFPI轉(zhuǎn)染組移植靜脈I和I/M分別為（0.62±0.05）mm2及0.51±0.08，均小于兩對照組（0.70±0.05）mm2、（0.72±0.04）mm2（P<0.05）和0.58±0.06、0.59±0.08（P<0.05）；M各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（1.23±0.11）mm2、（1.22±0.11）mm2和（1.23±0.12）mm2（P>0.05）。