miRNA在甘藍(lán)型油菜多倍體化過(guò)程中變化規(guī)律研究.pdf

1、自然界中存在許多天然的多倍體植物，如同源多倍體紫花苜蓿、馬鈴薯、桑、甘蔗和葡萄等;異源多倍體棉花、甘藍(lán)型油菜、小麥、菊花、郁金香、咖啡等?；蚪M加倍使多倍體可用的遺傳物質(zhì)增加，使之可以適應(yīng)更廣泛的自然環(huán)境，重復(fù)的基因可能會(huì)發(fā)生功能分化，獲得更強(qiáng)的抗旱能力、抗病蟲害能力、改變花期和器官大小等，從而使多倍體物種在自然選擇中具有更大的優(yōu)勢(shì)。人們經(jīng)常利用新合成的多倍體來(lái)模擬多倍體產(chǎn)生的過(guò)程，通過(guò)多倍體與親本種進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、普通遺傳學(xué)和

2、分子遺傳學(xué)等各個(gè)方面的比較發(fā)現(xiàn)多倍化引起的遺傳變異非常復(fù)雜，既有可遺傳的變異，如染色體重排和序列消除等，也有表觀遺傳變異，如甲基化、基因沉默、基因激活和smallRNA的改變等。
　　甘藍(lán)型油菜（AACC染色體組）是一種重要的異源多倍體油料作物。我國(guó)油菜種植面積在1.2億畝左右，是我國(guó)種植面積最大的油料作物，占食用油生產(chǎn)量的45％。甘藍(lán)型油菜的栽培歷史只有400多年，遺傳基礎(chǔ)較狹窄。而中國(guó)的白菜和甘藍(lán)栽培歷史悠久，資源非常豐富。將

3、二倍體親本物種甘藍(lán)（CC染色體組）和白菜（AA染色體組）基因資源導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜中能拓寬甘藍(lán)型油菜的遺傳基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用意義。甘藍(lán)和白菜雜交后染色體加倍，可以人工合成甘藍(lán)型油菜，人工合成的甘藍(lán)型油菜會(huì)出現(xiàn)非親本的表型，比如長(zhǎng)角果，大葉片等，是什么原因造成這些變異？各類sRNA在甘藍(lán)型油菜的多倍體化過(guò)程中起什么作用是本文關(guān)心的問(wèn)題。具體的研究問(wèn)題如下:(1)在不同的世代，miRNA的變化規(guī)律及對(duì)靶位點(diǎn)的調(diào)控規(guī)律是什么？(2)在多倍體化

4、過(guò)程中，各種類型的非編碼RNA(miRNA，siRNA，snRNA，snoRNA)是否存在相類似的變化規(guī)律？(3)多倍體與其親本種miRNA的差異及靶位點(diǎn)的差異是什么，這些差異對(duì)多倍體的進(jìn)化作用是什么？(4)新合成的多倍體與自然界存在的多倍體的miRNA之間進(jìn)行比較，是否有明顯差異，這種差異是否在多倍體進(jìn)化過(guò)程中起作用呢？
　　本研究采用兩種策略來(lái)研究小RNA在甘藍(lán)型油菜形成過(guò)程中的變異規(guī)律。第一種方法，利用人工合成的甘藍(lán)型油菜S

5、1-S4各世代、兩親本物種白菜型油菜和甘藍(lán)的DH系共6個(gè)樣進(jìn)行高通量測(cè)序，得到了各種不同類型的小RNA，并且進(jìn)行了分類、定位，比較了親本與不同世代及不同世代間的miRNA的長(zhǎng)度、前體序列、堿基組成、結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、靶基因功能等各方面的差異，試圖闡述miRNA在甘藍(lán)型油菜多倍化過(guò)程中所起的作用。
　　第二種，我們收集已經(jīng)發(fā)表的白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜miRNA的序列、名稱等信息，與第一種已經(jīng)檢測(cè)的miRNA合并，建立三個(gè)物種的miRN

6、A的合集，分別與三個(gè)物種的基因組進(jìn)行比對(duì)，提取鄰近序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，同時(shí)還分析了親本物種甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜中miRNA的序列本身的堿基組成規(guī)律、長(zhǎng)度分布規(guī)律及類型差異、一個(gè)miRNA調(diào)控多個(gè)靶基因的和多個(gè)miRNA調(diào)控一個(gè)靶基因的關(guān)系。本研究擬回答在甘藍(lán)型油菜的多倍體化產(chǎn)生過(guò)程中，miRNA在基因組上的位置、堿基組成、類型、產(chǎn)生miRNA的轉(zhuǎn)座子類型和對(duì)靶基因調(diào)控等結(jié)構(gòu)和功能上的變異。
　　1親本物種與人工合成甘藍(lán)型油菜不

7、同世代中sRNA和miRNA變異分析
　　(1)創(chuàng)建了甘藍(lán)與白菜雜交的人工合成甘藍(lán)型油菜不同世代的S群體，代數(shù)為S1-S4，群體大小為29個(gè)株系，S1采用組培的方式保存，其它采用單粒傳方式傳遞。
　　(2)通過(guò)高通量測(cè)序，去掉低質(zhì)量的序列read，甘藍(lán)、白菜型油菜和后代S1-S4代獲得的read數(shù)目分別為11412769、25393355、47982866、12566574、10029041和16421620個(gè)。在人工合成甘

8、藍(lán)型油菜過(guò)程中，從P到S1，S1到S2，S2到S3，S3到S4的不同世代傳遞過(guò)程中，Unique sRNAs共同序列比例平均為15.91％，15.87％，18.29％和21.64％，呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，反映了在多倍體化過(guò)程中sRNA序列隨著A、C染色體組交換的減少而變異趨勢(shì)逐步放緩。但從整體上看，UniquesRNAs占總序列的比例非常低，均為25％以下，說(shuō)明sRNAs在多倍體化過(guò)程中發(fā)生了巨大的變化。
　　(3)對(duì)于總sRNAs

9、序列，從P1-S1，S1-S2，S2-S3，S3-S4的不同世代傳遞過(guò)程中，總sRNAs共同序列比例平均為71.22％、61.88％、70.77％和70.97％，呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。
　　(4)甘藍(lán)、白菜型油菜和人工合成甘藍(lán)型油菜的S1-S4樣本中已知的和新預(yù)測(cè)的miRNA分別為2947、3005、3270、3114、3176和3226個(gè)。人工合成甘藍(lán)型油菜后代參與表達(dá)的miRNA類型要比親本種的平均值高4.64-9.88％，

10、說(shuō)明人工合成的甘藍(lán)型油菜中的多倍體化過(guò)程促進(jìn)了miRNA類型的增加。24nt的miRNA類型增加最多，其次為23nt、22nt和21 nt miRNA類型。
　　(5)通過(guò)對(duì)人工合成甘藍(lán)型油菜和親本物種的miRNA不同位的堿基分析，發(fā)現(xiàn)不同位的堿基表現(xiàn)出明顯的偏愛性。如第1位堿基偏愛性出現(xiàn)U，第3位堿基容易出現(xiàn)G;第19位極易出現(xiàn)C等。miRNA的首堿基也表現(xiàn)明顯的偏愛性。
　　(6)S1-S4中產(chǎn)生miRNA的轉(zhuǎn)座子數(shù)目明

11、顯高于親本種甘藍(lán)和白菜，說(shuō)明在多倍體化過(guò)程中誘發(fā)了能夠產(chǎn)生miRNA轉(zhuǎn)座子的激活，且種間雜交S1代激活最明顯，然后在后代中降低。
　　(7)各種小RNA的表達(dá)模式有明顯差異，miRNA主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)，其次為顯性效應(yīng)和超顯性效應(yīng)，S1特異性的和親本特異性的模式較少。而剩下的snRNA，snoRNA和來(lái)源于exon和intron的小RNA片段的表達(dá)模式主要是親本特異性和S1特異性表達(dá)模式，加性、顯性和超顯性比較少。
　　(8

12、)在親本甘藍(lán)和白菜中沒(méi)有表達(dá)而在后代(S1-S4)中表達(dá)的miRNA的比例為33.34％;在親本之中表達(dá)，但在后代不表達(dá)的比例為6.39％;在親本和后代都表達(dá)的為60.27％。這說(shuō)明，除開在親本和后代都表達(dá)的miRNA起主要作用外，新產(chǎn)生的miRNA也起重要作用，而沉默的miRNA在人工合成的甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生過(guò)程中起著的作用相對(duì)較小。
　　(9)甘藍(lán)和白菜平均每個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目分別為1.2和1.6，而在S1-S4后代中，

13、平均每個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目都在3以上，為親本種平均值的2倍以上，說(shuō)明在多倍體化后，每個(gè)miRNA的調(diào)控的靶基因的數(shù)目明顯增加，增強(qiáng)了多倍體物種的基因表達(dá)的調(diào)控的復(fù)雜性。
　　2親本物種與傳統(tǒng)甘藍(lán)型油菜miRNA變異分析
　　(1)從已經(jīng)發(fā)表的22篇文章里共找到了5104個(gè)miRNA，綜合前一部分測(cè)序后預(yù)測(cè)到的miRNA，共獲得的miRNA為6138個(gè)，只在親本種中檢測(cè)的miRNA為387個(gè)(6.3％)，僅在甘藍(lán)型油菜

14、中有的miRNA為80個(gè)，占1.3％;在親本種和多倍體后代中都有的miRNA為5671個(gè)(92.4％)。這說(shuō)明，在甘藍(lán)和白菜中間雜交的后代中，物種特異性的miRNA只占總數(shù)的很小比例，而在親本種和雜交后代中都存在的miRNA占絕大部分。
　　(2)分析蕓薹屬miRNA的堿基組成，為miRNA的鑒定和預(yù)測(cè)做好鋪墊。通過(guò)三個(gè)物種的每個(gè)miRNA堿基的A、U、G、C堿基組成分析發(fā)現(xiàn)，三物種間存在明顯差異?？傮w上看，U堿基的含量明顯偏高(

15、33.66％)，而G的含量明顯偏低(19.97％)，剩下的AC含量基本與理論值相符合。AU含量高于GC含量，特別是1和23位AU含量都高于60％，這或許與其功能相關(guān)。三個(gè)物種的miRNA堿基相比，并沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明關(guān)系相近的物種miRNA堿基組成有明顯的相似性。另外，所有的miRNA的第一個(gè)堿基AU含量(＞60％)遠(yuǎn)高于GC含量，且C堿基的含量明顯低于其它類型的堿基含量。
　　(3)在甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜中，有85％以上的mi

16、RNA分布在基因的間隔區(qū);其次為外顯子區(qū)域(3-7％)，在反義鏈上比正義鏈上分布更多;分布在內(nèi)含子區(qū)域?yàn)?-6％，有義鏈和反義鏈上分布的差異不明顯;而在重復(fù)區(qū)域內(nèi)的比例為1％以下。通過(guò)三個(gè)物種的miRNA基因組相比較，甘藍(lán)型油菜中的miRNA來(lái)源更分散和更廣泛。
　　(4)為了剖析重復(fù)序列的新功能，將miRNA定位的基因組位點(diǎn)進(jìn)行了轉(zhuǎn)座子序列的檢測(cè)。在甘藍(lán)、白菜和甘藍(lán)型油菜中分別檢測(cè)到425個(gè)、247和506個(gè)轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)中含有mi

17、RNA。甘藍(lán)中產(chǎn)生miRNA轉(zhuǎn)座子的數(shù)目比白菜中對(duì)應(yīng)的數(shù)值高72％，說(shuō)明甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生過(guò)程中，能產(chǎn)生miRNA的轉(zhuǎn)座子數(shù)目在多倍體化后數(shù)目增加，可能是多倍體化后miRNA數(shù)目增加的一個(gè)原因。
　　(5)甘藍(lán)型油菜中miRNA調(diào)控的靶基因數(shù)目明顯增加，表現(xiàn)為較低的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（如一個(gè)miRNA調(diào)控7個(gè)以下靶基因的數(shù)目）的比例下降，而超過(guò)一個(gè)miRNA調(diào)控25個(gè)靶基因以上的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有明顯增加。這說(shuō)明在多倍體化后，miRNA調(diào)控靶基因的數(shù)目

18、增加，增強(qiáng)了多倍體miRNA調(diào)控的復(fù)雜性。
　　綜上，在甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生的多倍體化過(guò)程中，各種類型的小RNA發(fā)生了較大變異，從低世代到高世代呈現(xiàn)逐步穩(wěn)定的趨勢(shì)，miRNA主要表現(xiàn)為加性效應(yīng)，其次為顯性效應(yīng)和超顯性效應(yīng)，新表達(dá)的miRNA在人工合成的甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用。在多倍體體化后，與親本種相比，多倍體的miRNA的數(shù)目、產(chǎn)生miRNA的轉(zhuǎn)座子數(shù)目和miRNA調(diào)控的靶基因數(shù)目均有明顯增加，從而使甘藍(lán)型油菜的調(diào)控多樣性更