非同步化正常人外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期限制點的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 無血清饑餓法同步化對數(shù)生長期細(xì)胞效果評價
　　目的：
　　評價傳統(tǒng)的無血清饑餓法同步化對數(shù)生長期人外周血淋巴細(xì)胞以及Molt-4細(xì)胞的效果。
　　方法：
　　將在體外培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的人外周血淋巴細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)到無血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時間點細(xì)胞的凋亡（Annexin-V/PI）、增殖（Ki67）和Cycl

2、in E的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　隨著體外饑餓時間的延長（24、48h），對數(shù)生長期的人外周血淋巴細(xì)胞凋亡率由（32.27±2.90）％增加到（61.82±2.47）％；ki67陽性率由（67.20±8.54）％減少到（51.87±0.59）％；G1期CyclinE+細(xì)胞的比例由饑餓前的（63.35±4.99）％分別減少至（46.04±1.84）％和（44.46％±2.97）％；S期細(xì)胞比例由饑餓前的（12.43±1.4

3、2）％分別增加到（16.73±0.96）％和（20.70±1.86）％；G2/M期細(xì)胞的比例由饑餓前的（1.49±0.98）％分別增加到（5.18±1.00）％和（8.06±1.38）％。
　　將對數(shù)生長期的Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48h后也得到了類似的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　按照傳統(tǒng)的無血清饑餓法操作，將對數(shù)生長期的人外周血淋巴細(xì)胞以及對數(shù)生長期的Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基中饑餓24、48

4、h，盡管凋亡率增加，增殖率下降，但是饑餓48h的時候處于S期的細(xì)胞比例依舊高達(dá)20％，并未同步化至靜止期。所以傳統(tǒng)的無血清饑餓法并不能使對數(shù)生長期的細(xì)胞完全同步化。
　　第二部分 非同步化正常人外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期限制點的研究
　　目的：
　　在非同步化的正常人淋巴細(xì)胞中探索細(xì)胞周期限制點（Restriction Point,R-point）存在的真實性，為其存在于G1期而非G0期提供證據(jù)。
　　方法：

5、　　新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后一部分轉(zhuǎn)入低血清（1％FBS）培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h。收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測CyclinE表達(dá)，分析G1-cyclinE-、G1-cyclinE+、S和G2/M各期陽性細(xì)胞比例；另一部分轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，流式細(xì)胞術(shù)通過檢測CyclinE表達(dá)，分析G1-cyclinE-、G1-cyclinE+、S和G2/M各期陽性細(xì)胞比例、G0/

6、G1期中P21表達(dá)，同時檢測細(xì)胞的增殖（Ki67）以及DNA摻入（BrdU）水平。
　　結(jié)果：
　　1、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、12、18、24、48h后，S期比例增加，靜止期的細(xì)胞逐漸進(jìn)入細(xì)胞周期。
　　2、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后分別轉(zhuǎn)入低血清（1％FBS）培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，此過程中S期細(xì)胞比例在13％到24％

7、不等，不能實現(xiàn)同步化細(xì)胞的緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞周期。
　　3、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，盡管G1期細(xì)胞有75％左右表達(dá)CyclinE，但并未有細(xì)胞進(jìn)入S期；18h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中，S期、G2/M分別有19％、2％左右細(xì)胞表達(dá)CyclinE；24h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中，S期、G2/M中CyclinE的表達(dá)率則分別有23％和3.7％左右。
　　4、新

8、鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，細(xì)胞Ki67陽性表達(dá)率僅有（7.83±1.36）％，18h和24h則分別增加到（21.89±2.72）％和（39.98±7.51）％。
　　5、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，BrdU摻入率僅有（2.18±1.37）％，而18h和24h BrdU摻入率則分

9、別增加到（5.23±0.53）％和（12.06±3.49）％。
　　6、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h，G0/G1期細(xì)胞P21陽性表達(dá)率為（82.45±4.61）％，而18h和24h則分別降到（49.89±19.11）％和（41.09±15.55）％。
　　結(jié)論：
　　1、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后會逐漸進(jìn)入細(xì)

10、胞周期，作為細(xì)胞周期限制點的研究對象更加科學(xué)合理。
　　2、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1％PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入低血清（1％FBS）培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，此過程中S期細(xì)胞始終保持較高比例，不能實現(xiàn)同步化細(xì)胞的緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞周期，所以轉(zhuǎn)入低血清（1％FBS）培養(yǎng)基中無法完成細(xì)胞周期限制點的研究。
　　3、本研究首次證實，在非同步化的正常人外周血淋巴細(xì)胞中確實也存在細(xì)胞周期限制點，且存在于G1期而非G0期。對于經(jīng)過1