涼血化瘀方治療濕性老年性黃斑變性回顧臨床研究及作用機(jī)制探討.pdf

1、研究目的：
　　客觀評(píng)價(jià)葛根素及銀杏葉提取物對(duì)眼血流的改善作用；從分子生物學(xué)的角度研究葛根素及銀杏葉提取物對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS及ET-1的影響，初步探討葛根素及銀杏葉提取物改善視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血流的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床用藥提供客觀依據(jù)和指導(dǎo)，同時(shí)也為今后研究活血中藥提供新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1.選取前部缺血性視神經(jīng)病變患者41名，隨機(jī)分為2組，進(jìn)行葛根素或銀杏葉提取物注射

2、液靜脈點(diǎn)滴聯(lián)合口服補(bǔ)陽還五湯治療，運(yùn)用彩色超聲多普勒技術(shù)比較用這兩種藥物治療前后患者患眼動(dòng)脈及視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的收縮期峰值血流速度、舒張術(shù)期血流速度及阻力指數(shù)，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組參數(shù)進(jìn)行比較和分析。
　　2.選取前部缺血性視神經(jīng)病變患者41名，隨機(jī)分為2組，進(jìn)行葛根素或銀杏葉提取物注射液靜脈點(diǎn)滴治療，運(yùn)用球結(jié)膜微循環(huán)監(jiān)測(cè)技術(shù)比較用這兩種藥物治療前后患者的球結(jié)膜的血流有無變化，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組加權(quán)積分

3、進(jìn)行比較和分析。
　　3.分別培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)葛根素及銀杏葉提取物對(duì)這兩種細(xì)胞增殖活性的影響；采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)葛根素及銀杏葉提取物對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS及ET-1的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.葛根素及銀杏葉提取物聯(lián)合口服補(bǔ)陽還五湯治療后患者眼動(dòng)脈PSV治療后較治療前明顯增加，且治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EDV治療后較治療前

4、增加，但治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RI治療后較治療前降低，但治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；患者視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈PSV治療后較治療前明顯增加，且治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EDV治療后較治療前增加，但治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RI治療后較治療前降低，但治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.葛根素組輸液后球結(jié)膜微循環(huán)加權(quán)積分小于輸液前積分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

5、05)；銀杏葉提取物組輸液后球結(jié)膜微循環(huán)加權(quán)積分小于輸液前積分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：Ⅷ因子定位于胞漿中，免疫熒光化學(xué)顯示所培養(yǎng)細(xì)胞胞漿中有黃綠色的熒光著色，胞核呈黑綠色，整個(gè)細(xì)胞輪廓清楚，表明細(xì)胞為內(nèi)皮源性細(xì)胞。
　　4.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵因素：20 g·L-1明膠可獲得較高的細(xì)胞貼壁率；此外，內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基的使用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的維持培養(yǎng)非常關(guān)鍵。本研究采用DMEM及Ham’F1

6、2作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎牛血清、ECGF以及肝素，結(jié)果表明已可滿足內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)；胎牛血清的濃度及質(zhì)量對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)也有至關(guān)重要的作用；內(nèi)皮細(xì)胞還是密度依賴性生長(zhǎng)的細(xì)胞，接種的細(xì)胞太稀，將不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，3×104個(gè)/ml的密度較利于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　5.MTT比色法檢測(cè)葛根素對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示葛根素對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)增殖效應(yīng)。24及48h五個(gè)濃度葛根素組0D值均高于空白對(duì)照組(P<0.

7、05)，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明葛根素有促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用；MTT比色法檢測(cè)銀杏葉提取物對(duì)RVECs的作用，結(jié)果顯示24 h五個(gè)濃度銀杏葉提取物組0D值均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯。48h0.001、0.01、0.1μ g/ml三個(gè)濃度0D值均高于空白對(duì)照組(P<0.05)：0.0001μ g/ml組0D值高于空白對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；1μ

8、 g/ml組0D值低于空白對(duì)照組(P<0.05)，說明銀杏葉提取物有促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　6.MTT比色法檢測(cè)葛根素對(duì)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示24及48h四個(gè)濃度葛根素組0D值均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明葛根素有促進(jìn)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用；MTT比色法檢測(cè)銀杏葉提取物對(duì)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示24及48h四個(gè)濃度銀杏葉

9、提取物組0D值均高于空白對(duì)照組(P<0.05)，脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，并且隨藥物濃度增加0D值也增加，說明銀杏葉提取物有促進(jìn)脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　7.與陰性對(duì)照組相比，銀杏葉低濃度及高濃度組、葛根素低濃度及高濃度組eNOS的相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.01)，且隨著藥物濃度的增加eNOS的表達(dá)也增加；銀杏葉低濃度及高濃度組、葛根素低濃度及高濃度組ET-1的相對(duì)表達(dá)量均下降(P<0.01)，銀杏葉組低濃度及高濃度組

10、間ET-1的相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，葛根素組ET-1的表達(dá)隨著藥物濃度的增加而下降，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)
　　研究結(jié)論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)葛根素及銀杏葉提取物聯(lián)合口服補(bǔ)陽還五湯治療后能提高AION患者眼部眼動(dòng)脈和視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的灌注壓，改善眼動(dòng)脈和視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的血流速度，從而改善視神經(jīng)的缺血狀態(tài)。為了觀察單獨(dú)應(yīng)用葛根素及銀杏葉提取物后對(duì)眼血流的作用，本研究還進(jìn)行了單次輸液前及輸液后30分

11、鐘對(duì)球結(jié)膜血流的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)葛根素及銀杏葉提取物還能改善AION患者球結(jié)膜的血流，據(jù)此推測(cè)葛根素及銀杏葉提取物可以改善眼動(dòng)脈及睫狀前動(dòng)脈的血流。所以綜合彩色多普勒血流顯像及球結(jié)膜血流的觀測(cè)結(jié)果，可以推測(cè)葛根素及銀杏葉提取物能改善AION患者眼部的血流量，不僅能改善視網(wǎng)膜的血供，也能改善脈絡(luò)膜的血供。
　　2.無論是體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞還是脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，加藥組的eNOS表達(dá)量均增加，ET-1的表達(dá)均下調(diào)，據(jù)此可以推測(cè)葛根