川金絲猴雌二醇和孕酮檢測方法評估及其在繁殖周期水平研究.pdf

1、川金絲猴是我國的一級保護動物，數(shù)量稀少，被世界保護聯(lián)盟列為瀕危物種。有研究表明川金絲猴為季節(jié)性繁殖，每年9～12月為交配、懷孕的高峰期也被稱為繁殖期，次年3～5月為分娩期即非繁殖期，每兩年生一胎，另外川金絲猴的生活環(huán)境惡劣，新生個體的死亡率高，這些因素綜合導致了川金絲猴數(shù)量的逐漸降低，因此急需有效的方法對此物種進行保護，并能有效的提高其繁殖率。但是，目前關(guān)于川金絲猴繁殖狀況的研究較少，其詳細的繁殖生理狀況不清晰，因此本研究以神農(nóng)架籠養(yǎng)雌

2、性川金絲猴為研究對象，研究在不同的繁殖時期（即每年的3～5月和9～12月）雌性川金絲猴體內(nèi)的雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平變化，為提高其繁殖率提供幫助。
　　由于川金絲猴為野生動物，保定、采血都會引起川金絲猴的應(yīng)激反應(yīng)，影響激素的分泌，不利于研究的開展，因此本研究采用非損傷性激素檢測方法，即通過研究糞便和尿液中的激素含量來研究神農(nóng)架雌性川金絲猴體內(nèi)的激素含量變化，進而研究其生殖生理狀況。但是由于目前關(guān)于川金絲猴激素檢測的研究較少

3、，因此本研究分別對尿液中的激素檢測方法和糞便中的激素提取方法進行研究，獲得合適的檢測方法再進行下一步的深入研究。
　　1.本研究在2013年10～12月在神農(nóng)架林區(qū)的人工繁育中心分別收集雌性川金絲猴尿液和糞便各15份。每份尿液樣品平均分為三份，分別采用放射性免疫法(RIA)、化學發(fā)光微粒子免疫檢測法(CMIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來檢測尿液樣本中的E2和P4的含量。研究結(jié)果表明RIA的檢測結(jié)果與CMIA的結(jié)果之間的差異不

4、顯著，而這兩者與ELISA的檢測結(jié)果之間的差異顯著，且RIA與CMIA檢測結(jié)果的趨勢相同，因此，綜合各方面因素考慮本研究選擇CMIA用于下一步實驗。每份糞便樣品平均分為兩份，分別采用勻漿法和冷凍干燥法提取其中的激素，然后采用CMIA檢測上清中的E2和P4的含量，研究結(jié)果表明勻漿法檢測的檢出率高于冷凍干燥法，兩者差異顯著，因此勻漿法更適合于提取糞便中的激素，這為下一步糞便激素的提取研究奠定基礎(chǔ)。
　　2.本研究分別在2013年10～

5、12月，2014年3～5月和9～12月期間，在神農(nóng)架林區(qū)的人工繁育中心收集了5只雌性川金絲猴（1#、2#、3#、4#、5#）的尿液樣品1499份，采集時間一共為8個月。在樣品采集期間，每個個體的月經(jīng)出血時間被詳細記錄。采用CMIA檢測尿液中的E2和P4含量，同時檢測尿液中的肌酐(Cr)含量，尿液最終的激素濃度為檢測的激素濃度除去肌酐含量所得的值。研究結(jié)果表明在繁殖季節(jié)，雌性川金絲猴的E2和P4水平明顯高于非繁殖季節(jié)，且在繁殖季節(jié)的發(fā)情周

6、期(21～27d)明顯短于非繁殖季節(jié)的發(fā)情周期(41～46d)。由月經(jīng)出血推算雌性川金絲猴的發(fā)情周期與由激素檢測得到的發(fā)情周期之間的差異不顯著。在懷孕早期E2和P4的水平分別在受孕后的第14d和12d開始上升，且在此之后的整個懷孕期都保持較高的激素水平。由檢測的哺乳期E2和P4的水平可知，在哺乳期雌性川金絲猴體內(nèi)的E2和P4含量都維持在較低水平，且此較低水平的持續(xù)時間為7個月。
　　3.本研究在2013年10～12月在神農(nóng)架林區(qū)的

7、人工繁育中心收集了雌性川金絲猴（1#、2#、3#、4#）的糞便樣品93份，采用勻漿法處理糞便樣品，提取糞便中的激素之后，采用CMIA檢測上清中的E2和P4含量，研究結(jié)果表明在繁殖季節(jié)1#糞便中的E2含量具有周期性，而P4含量未呈現(xiàn)明顯規(guī)律，2#、3#和4#糞便中的E2和P4的含量具有明顯的變化，但是未發(fā)現(xiàn)周期性。同時本研究這4只雌性川金絲猴糞便與尿液中激素含量的相關(guān)性，結(jié)果表明雌性川金絲猴個體糞便和尿液中的激素含量具有相關(guān)性，但是不同個