三維微圖案超細(xì)纖維支架調(diào)控功能性組織形成的研究.pdf

1、體內(nèi)大多數(shù)組織由多種細(xì)胞組成，且這些細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)在組織中有序排列，以發(fā)揮特定的組織功能。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，研究者們一直致力于在體外模擬和重建這些復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，其中圖案化組織工程支架在調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分布和多細(xì)胞共培養(yǎng)等作用明顯。靜電紡纖維支架具有高的比表面積和類(lèi)似于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，作為組織工程支架具有很大的優(yōu)勢(shì)。但目前將圖案化技術(shù)與電紡技術(shù)結(jié)合起來(lái)構(gòu)建圖案化纖維支架，并調(diào)控不同種類(lèi)細(xì)胞的空間分布、重建組

2、織結(jié)構(gòu)微環(huán)境的研究仍較少。據(jù)此，本論文設(shè)計(jì)了光刻掩模，運(yùn)用光刻和磁控濺射工藝制得圖案化接收板，采用普通靜電紡絲設(shè)備獲得了圖案化纖維支架。為模擬肝小葉和心肌片層的結(jié)構(gòu)，通過(guò)圖案化纖維支架分別實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞和肝組織中其他相關(guān)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和心肌組織中其他相關(guān)細(xì)胞的共培養(yǎng)，較好地維持了肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞的活力。在此基礎(chǔ)上，將圖案化共培養(yǎng)肝細(xì)胞體系、心肌細(xì)胞體系作為藥物代謝和藥物篩選的體外模型，顯示出較好的體外和體內(nèi)結(jié)果相關(guān)性。
　　利用光刻

3、和磁控濺射工藝制得了圖案化接收板，結(jié)合普通靜電紡絲設(shè)備制備了圖案化纖維膜，方法簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng);圖案的形狀、尺寸和排列方式可控;制得的圖案化纖維膜溝脊結(jié)構(gòu)明顯，圖案區(qū)域的纖維具有較高的定向性。成纖維細(xì)胞在不同尺寸的圖案化纖維支架上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)支架能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的空間分布，使其在預(yù)定的圖案區(qū)域生長(zhǎng)，并滲透進(jìn)入纖維支架內(nèi)部;同時(shí)細(xì)胞沿纖維取向生長(zhǎng)，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)呈現(xiàn)定向分布等特征。
　　合成了乳糖改性聚乳酸，發(fā)現(xiàn)混紡比例為5∶5的乳糖改

4、性聚乳酸/聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PELA)復(fù)合支架能有效維持肝細(xì)胞的活力和功能，原代肝細(xì)胞形成了直徑約為60μm的肝細(xì)胞球體。將原代肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別接種在上述復(fù)合纖維、PELA纖維的圖案化支架上，通過(guò)圖案化纖維的層層鍥合，實(shí)現(xiàn)了兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)。在15天的培養(yǎng)中，與肝細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)肝細(xì)胞能較好地維持肝細(xì)胞活力、白蛋白分泌、尿素合成和P450酶活力等。在此基礎(chǔ)上，將原代肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于三種不同的

5、圖案化纖維支架中，通過(guò)層層鍥合組裝的方式，成功構(gòu)建了類(lèi)似體內(nèi)肝小葉的基質(zhì)結(jié)構(gòu)。三種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)較好，均能分泌各自的特征性蛋白，肝細(xì)胞球體內(nèi)生成了膽小管，成纖維細(xì)胞滲透生長(zhǎng)進(jìn)入圖案化纖維支架內(nèi)部，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出較好的毛細(xì)血管生成能力。
　　以7-芐氧基-4-三氟甲基香豆素、7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素和7-羥基香豆素等作為底物，檢測(cè)了圖案化共培養(yǎng)肝細(xì)胞中藥物代謝相關(guān)酶的活性，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)肝細(xì)胞中CYP3A4、CYP2C9及II相代

6、謝酶的活力均能維持在較高水平。采用咪達(dá)唑侖、睪酮、甲苯磺丁脲、華法林和對(duì)乙酰氨基酚藥物等研究了共培養(yǎng)肝細(xì)胞的藥物代謝行為，發(fā)現(xiàn)上述藥物在共培養(yǎng)體系中的代謝清除率接近體內(nèi)數(shù)據(jù)，說(shuō)明能較準(zhǔn)確地反映體內(nèi)肝臟的藥物代謝情況。以利福平和谷胱甘肽作為誘導(dǎo)劑，酮康唑和丙磺舒作為抑制劑，證明了共培養(yǎng)肝細(xì)胞能敏感地響應(yīng)藥物的誘導(dǎo)和抑制作用。上述結(jié)果顯示出圖案化共培養(yǎng)肝細(xì)胞體系適合在體外進(jìn)行藥物代謝和毒性的評(píng)價(jià)。
　　制備了PELA/碳納米管的圖案化

7、纖維支架，纖維呈現(xiàn)核殼結(jié)構(gòu)，具有一定的導(dǎo)電性。在圖案纖維支架上接種原代心肌細(xì)胞、原代心肌成纖維細(xì)胞，將內(nèi)皮細(xì)胞接種到PELA圖案纖維支架上，通過(guò)圖案化纖維的層層鍥合組裝，構(gòu)建了心肌細(xì)胞平面共培養(yǎng)的微環(huán)境。該體系不僅模擬了心肌組織中不同細(xì)胞的排列分布，更表現(xiàn)出與體內(nèi)心肌相似的生物化學(xué)和電生理特性。針對(duì)目前組織工程化心肌的厚度不夠，為了使所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞更接近于體內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了具有眾多孔道結(jié)構(gòu)的圖案化纖維支架，并模擬心肌細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)

8、所需的力學(xué)微環(huán)境，構(gòu)建了三維心肌組織，三種細(xì)胞均能較好地生長(zhǎng)，共培養(yǎng)心肌細(xì)胞能長(zhǎng)時(shí)間維持自發(fā)的跳動(dòng)，孔道結(jié)構(gòu)促進(jìn)了細(xì)胞在支架內(nèi)部的滲透生長(zhǎng)和排列，內(nèi)皮細(xì)胞也表現(xiàn)出了血管化能力。
　　采用實(shí)時(shí)拍攝記錄共培養(yǎng)支架上心肌細(xì)胞的搏動(dòng)信號(hào)，在體外構(gòu)建的共培養(yǎng)心肌細(xì)胞體系開(kāi)展了藥物篩選的研究。通過(guò)觀察奎尼丁、紅霉素和甲磺胺心定等對(duì)心肌細(xì)胞的作用效果和起效時(shí)間，對(duì)比體內(nèi)和體外測(cè)定的半效應(yīng)濃度(EC50)值，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)心肌細(xì)胞能準(zhǔn)確地反映藥物在體