CaCCs通道鈣離子依賴性分子機制的研究.pdf

1、　　鈣激活氯離子通道(CaCCs)是一種廣泛存在的氯離子通道,參與眾多生理功能,如：上皮細胞的氯離子分泌、嗅覺傳導以及平滑肌收縮等。由于通常情況下很難將CaCCs介導的電流和鈣離子依賴性陽離子流以及非鈣離子依賴性氯離子流分開,所以對其電生理特性的研究遠遠滯后于其他離子通道。近來,TMEM16A被確認為CaCCs通道的分子基礎(chǔ),這為進一步研究其電生理特點提供了可能。
　　鈣離子和電壓雙重依賴性激活機制是 TMEM16A 通道典型

2、的電生理特性。然而,在TMEM16A通道內(nèi)部卻不存在已知的鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域,如CaM的EF-hand,BK通道內(nèi)的“Ca2+-bowl‖等。而確定TMEM16A通道的鈣離子結(jié)合位點是研究其鈣依賴性激活機制的前提。
　　本文結(jié)合課題組龐春麗博士理論模擬結(jié)果和高崇森同學的實驗結(jié)果,分為兩個部分來研究TMEM16A的激活機制：
　　一、 TMEM16A通道Ca2+結(jié)合位點的研究
　　本文首次采用同源模建和分子動力

3、學模擬等理論方法結(jié)合定點突變和膜片鉗技術(shù),以TMEM16A通道為研究對象,力圖明確通道內(nèi)鈣離子結(jié)合位點,得到以下結(jié)論：
　　1. TMEM16A通道胞內(nèi)側(cè)第一個Loop內(nèi)的D439、E444和E447三個氨基酸同鈣離子直接相互作用,并與三個水分子共同形成鈣離子結(jié)合位點。
　　2. 在以上形成鈣離子結(jié)合位點的三個氨基酸中,D439 和 E444 各貢獻一個氧原子,而E447貢獻兩個氧原子和鈣離子相互作用,即E447對于

4、通道對鈣離子親和力影響最大。
　　3. TMEM16A通道胞內(nèi)側(cè)第一個Loop內(nèi)的D452和E457盡管也可以和水分子共同形成鈣離子結(jié)合位點,但是它們并不會影響通道門控動力學行為。
　　二、 二價陽離子激活TMEM16A通道機制的初步探討
　　本課題組和其他實驗室前期研究表明,Ca2+以外的其他二價陽離子對TMEM16A通道也具有一定的激活作用。對于不同二價陽離子激活TMEM16A的研究是研究該通道鈣離子依

5、賴性激活機制的有益補充。然而,就二價離子和鈣離子在激活TMEM16A通道過程中相互關(guān)系的研究尚未見文獻報道。
　　本論文以表達于HEK293細胞系的TMEM16A為研究對象,采用膜片鉗內(nèi)向外記錄模式,通過研究不同二價陽離子共同存在時對CaCCs的影響,從而判斷二價陽離子之間是否存在協(xié)同作用。實驗結(jié)果表明：
　　1. 兩種二價陽離子共同存在時( Ca2+ +Sr2+,Ca2++Ni2+),并不能更大程度的激活TMEM1