滇蛙皮膚抗感染多肽的分離純化、分子克隆及多樣性研究.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一類小分子多肽(分子量低于10 KDa)，最早因為具有廣譜抗菌活性被發(fā)現(xiàn)及命名，后來因為不容易誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生耐藥性而引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)：抗菌肽是先天免疫最終效應(yīng)物之一，在防御和消除外來病原體(細菌、真菌、病毒、原蟲等)對機體的侵襲和破壞、維持機體正常的生理機能等方面發(fā)揮重要的作用，是炎癥反應(yīng)、免疫激活和創(chuàng)傷愈合等過程中的重要活性因子。在

2、植物、動物(昆蟲、兩棲類、人類)、甚至微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有抗菌肽(樣)的存在。抗感染多肽(Anti-infective peptides)概念的提出，對抗菌肽在名稱上進行了功能性的修正。 兩棲類皮膚分泌液是抵御微生物侵染的第一道防御屏障，自1987年Zasloff等人從非洲爪蟾皮膚中分離到Magainin以來，各國學(xué)者對兩棲類皮膚分泌液的研究越來越廣泛和深入起來。滇蛙(Rana pleuraden)，是我國特有種之一，主要分布在我

3、國云南、貴州、四川等地，藥用及經(jīng)濟價值尚未被發(fā)掘，有廣闊的開發(fā)利用空間。 在本論文中，我們利用生物化學(xué)及分子生物學(xué)的手段對滇蛙皮膚的抗感染多肽進行了研究。 通過兩步法(Sephadex G-50和RP-HPLC)對滇蛙皮膚分泌液的成分進行分離純化，我們得到2種具有抗菌活性的多肽，命名為pleurain-A1和pleurain-A2。Edman降解法測定其全序列，分別是SIITMTKEAKLPQLWKQIACRLYNTC和

4、SIITMTKEAKLPQSWKQIACRLYNTC。運用基質(zhì)輔助激光解離離子化技術(shù)(MALDI-TOF-MS)測定其分子量分別為3048.5 Da和3024.8 Da。 使用CLONTECH公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit構(gòu)建了滇蛙皮膚的cDNA文庫，根據(jù)蛋白序列比對，以相近的抗菌肽信號肽N端序列設(shè)計引物序列，我們從滇蛙皮膚抗感染多肽亞克隆文庫中，篩選得到13

5、5條由抗菌肽信號肽編碼的抗感染多肽cDNA核酸序列(GenBank accession no.： EF613243-EF613259，EF621707-EF621709，EU138029-EU138143)，編碼34種多肽，分屬于12個抗菌肽家族，pleurain-As(4個)，pleurain-Bs(4個)，pleurain-Cs(2個)，pleurain-Ds(6個)，pleurain-E(1個)，pleurain-F(1個)，pl

6、eurain-Gs(9個)，pleurain-Js(2個)，pleurain-K(1個)，Lividin-RP(1個)，pleurain-Ms(2個)，pleurain-N(1個)。對這些抗感染多肽的分子多樣性進行研究發(fā)現(xiàn)，這12個家族的抗菌肽前體序列的SPD區(qū)域(Signal and PropieceDomain，SPD)非常保守，Mega及DAMBE分子遺傳分析表明，它們可能起源于同一個祖先基因。對其進行同義突變率及錯義突變率檢測發(fā)

7、現(xiàn)，它們可能經(jīng)受著不同的選擇壓力。 隨機選取10個家族的抗感染多肽進行人工合成，研究其生物學(xué)功能多樣性發(fā)現(xiàn)：pleurain-A1，pleurain-D4，pleurain-G7，pleurain-M1具有廣譜的抗微生物活性，pleurain-J1表現(xiàn)出較窄的抗菌譜(抗金黃色葡萄球菌)，而其他家族的肽類物質(zhì)并不直接具有殺死微生物的能力。同一家族的抗感染多肽pleurain-G1和pleurain-G7表現(xiàn)出明顯不同的抗菌活性，p