影響豬體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)效率因素的研究.pdf

1、豬的體細(xì)胞克隆在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，尤其體現(xiàn)在作為研究人類疾病的動(dòng)物模型、人類異種器官移植方面。本研究利用屠宰場(chǎng)豬卵巢，對(duì)體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)中的一系列相關(guān)因素進(jìn)行研究，為轉(zhuǎn)基因克隆豬的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果如下： 不同時(shí)間段添加外源激素對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響：豬卵母細(xì)胞以NCSU23+10％pFF+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+10ng/mLEGF為成熟液體外培養(yǎng)44h：前22h在培養(yǎng)液中添加激素

2、，后22h不加激素以及添加激素連續(xù)培養(yǎng)44h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：后22h去除激素顯著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率(P＜0.05)，對(duì)卵母細(xì)胞的核成熟影響不大，因此，在體外成熟的后22h將激素去除是有必要的。 豬體外成熟卵母細(xì)胞孤雌激活的方案：(1)不同的電場(chǎng)強(qiáng)度的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度為2.0kv/cm時(shí)，卵裂率、囊胚率均顯著高于其他兩組(1.6kv/cm，2.4kv/cm)(P＜0.05)；(2)放線菌酮(cycloheximide，CHX

3、)不同添加方式對(duì)激活效果的影響：發(fā)現(xiàn)電激活前用10μgCHX處理MⅡ期卵母細(xì)胞，卵裂率有顯著的提高(P＜0.05)，囊胚發(fā)育率也有提高；電激活前用10μgCHX處理MⅡ期卵母細(xì)胞0、10、60min，與對(duì)照組相比，處理卵母細(xì)胞60min，囊胚率顯著提高(P＜0.05)；MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活后，輔助10μgCHX作用，卵裂率、囊胚率都有顯著的提高(P＜0.05)；MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活后，輔助10μgCHX作用(3h、4h、5h)，

4、提高了孤雌胚胎發(fā)育率，各組之間差別不大：MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行電激活1h后再用CHX輔助激活，與激活后直接加入CHX相比，卵裂率、囊胚率有顯著的提高(P＜0.05)。 不同培養(yǎng)密度對(duì)孤雌胚胎發(fā)育的影響：25、45、65枚/50μl的培養(yǎng)密度下，卵裂率、囊胚率沒有顯著的差異(P＞0.05)，但45枚/50μl的培養(yǎng)密度下胚胎的發(fā)育率稍高。 TSA對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的影響：5nMTSA處理對(duì)卵母細(xì)胞體外核成熟無顯

5、著影響，并且顯著提高了其后孤雌胚胎卵裂率、囊胚率(P＜0.05)；50nMTSA處理顯著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率(P＜0.05)；50nMTSA處理24h能顯著提高胚胎的卵裂率、囊胚率(P＜0.05)。 (1)重構(gòu)胚構(gòu)建后，有必要恢復(fù)一段時(shí)間再進(jìn)行融合，研究了不同的恢復(fù)時(shí)間對(duì)于(SomaticCellNuclearTransfer，SCNT)胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示，恢復(fù)時(shí)間(1～2h)時(shí)，重構(gòu)胚融合率顯著提高，但是，導(dǎo)致

6、碎裂率的顯著上升(P＜0.05)，影響了囊胚的發(fā)育；恢復(fù)20～40min有利于胚胎的正常發(fā)育；(2)不同的融合激活間隔時(shí)間對(duì)SCNTs發(fā)育的影響，融合后不再進(jìn)行二次激活的組作為對(duì)照，與融合后0.5～1h、1.5～2h再次進(jìn)行激活的效果相比，融合激活間隔時(shí)間為1.5～2h時(shí)顯著提高了胚胎發(fā)育率(P＜0.05)。對(duì)比供體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因與否對(duì)克隆胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞作為核供體時(shí)，早期克隆胚胎的發(fā)育無顯著差異(P＞0.05)。