棉蚜對(duì)吡蟲啉的代謝抗性分子機(jī)制研究.pdf

1、棉蚜Aphis gossypii（Glover）屬同翅目蚜科，是世界性分布的多食性害蟲，抗藥性發(fā)展迅速，抗性譜廣，抗性治理難度大。吡蟲啉是第一個(gè)商品化的新煙堿類殺蟲劑，是目前防治棉蚜等刺吸式口器害蟲的首選藥劑。隨著吡蟲啉的大量頻繁使用，包括棉蚜在內(nèi)的多種害蟲對(duì)其產(chǎn)生了抗藥性。研究表明，昆蟲對(duì)吡蟲啉的代謝抗性主要與CYP基因編碼的P450酶代謝活性升高有關(guān)。但大部分研究結(jié)果尚缺乏直接的證據(jù)證明這些基因編碼的酶能夠代謝吡蟲啉，且不同昆蟲中起

2、關(guān)鍵作用的CYP基因也有差異。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，棉蚜對(duì)吡蟲啉的抗性主要與P450酶的活性升高有關(guān)，但目前尚未涉及到P450基因介導(dǎo)的棉蚜對(duì)吡蟲啉的代謝分子機(jī)制研究。本文檢測(cè)了山東省主要棉區(qū)棉蚜對(duì)吡蟲啉的抗性，并以田間抗性種群（XJ和BZ）、室內(nèi)篩選的抗性種群（RS，抗性72.6倍）和敏感種群（SS）為試材，通過增效試驗(yàn)、酶活測(cè)定、吡蟲啉體內(nèi)代謝、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、RACE等技術(shù)，通過比較棉蚜抗敏品系體內(nèi)CYP基因的mRNA表達(dá)水平

3、，篩選并克隆出與抗性相關(guān)的CYP基因。并將克隆的CYP基因進(jìn)行異源表達(dá)，采用生化及LC-MS/MS技術(shù)，分析該基因異源表達(dá)產(chǎn)物活性及其對(duì)吡蟲啉的離體代謝作用。研究結(jié)果證實(shí)P450基因CYP6CY3-Ag過量表達(dá)能夠?qū)е旅扪翆?duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性。具體研究結(jié)果如下：
　　采用毛細(xì)管微量點(diǎn)滴法測(cè)定了山東主要棉區(qū)12個(gè)田間棉蚜種群對(duì)吡蟲啉的抗性水平，結(jié)果表明，供試的12個(gè)田間棉蚜種群均對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了不同水平的抗性，與敏感種群相比，抗性倍數(shù)在3

4、.73—12.90之間。其中，夏津（XJ）和濱州（BZ）兩個(gè)種群的抗性水平最高，抗性倍數(shù)分別為10.36和12.90；禹城（YC）和高唐（GT）兩個(gè)種群的抗性水平最低，抗性倍數(shù)分別為3.73和4.24；其余8個(gè)田間種群對(duì)吡蟲啉的抗性倍數(shù)在5.27—9.13之間。
　　比較了酶抑制劑PBO（胡椒基丁醚）在敏感種群（SS）和3個(gè)抗性棉蚜種群（XJ、BZ、RS）中對(duì)吡蟲啉的增效作用，結(jié)果表明，PBO對(duì)BZ種群的增效作用最顯著，為5.43

5、倍；其次是RS種群和XJ種群，分別為3.88倍和2.65倍；對(duì)SS種群的增效作用最不明顯，為1.19倍。通過對(duì)底物PNOD（對(duì)硝基苯甲醚）的O-脫甲基作用測(cè)定，比較4個(gè)棉蚜種群的細(xì)胞色素P450酶的活性，結(jié)果表明，RS種群細(xì)胞色素P450酶活性最高，是敏感棉蚜種群的4.89倍；其次是BZ種群，是SS種群的3.98倍；XJ種群細(xì)胞色素P450酶活性與敏感種群差異不明顯，僅為1.53倍。
　　采用LC-MS/MS技術(shù)比較了RS抗性種群

6、和SS敏感種群對(duì)吡蟲啉的體內(nèi)代謝能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間的增加，兩種群體內(nèi)吡蟲啉的含量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中，敏感種群棉蚜體內(nèi)吡蟲啉含量在處理后10h達(dá)到最大，為0.28±0.03 ng/mg棉蚜；抗性種群棉蚜體內(nèi)吡蟲啉含量在處理后1h達(dá)到最大，為0.17±0.02 ng/mg棉蚜；處理后24h，敏感種群棉蚜體內(nèi)吡蟲啉的含量是抗性種群棉蚜的1.91倍。而兩種群體內(nèi)4/5-羥基吡蟲啉的含量呈現(xiàn)一直增加趨勢(shì)，且抗性種群體內(nèi)的4/

7、5-羥基吡蟲啉含量始終大于敏感種群。處理后24h，抗性和敏感種群棉蚜體內(nèi)4/5-羥基吡蟲啉的含量分別為2910±80和990±110峰面積/mg棉蚜，抗性種群是敏感種群的2.94倍。結(jié)果表明，兩個(gè)棉蚜種群均能在體內(nèi)代謝吡蟲啉，代謝產(chǎn)物主要為4/5-羥基吡蟲啉，且抗性種群棉蚜對(duì)吡蟲啉的代謝能力要明顯高于敏感種群棉蚜。
　　分別根據(jù)CYP4和CYP6家族基因的氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，采用RT-PCR技術(shù)，分別獲得了大約440 bp和

8、390 bp的目的基因片段，克隆測(cè)序后，最終獲得了15條P450基因序列，在GenBank中通過BLASTX或BLASTP比對(duì)并排除同一基因家族中的相同基因或者相同基因的等位基因，最終獲得了4個(gè)CYP4家族基因和3個(gè)CYP6家族基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較了這7個(gè)P450基因在RS抗性種群和SS敏感種群中mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CYP4-like2-Ag、CYP4-like4-Ag、CYP6-like1-Ag和CYP6-l

9、ike3-Ag4個(gè)基因在RS種群中的mRNA表達(dá)量要明顯高于SS種群，其在RS種群中的表達(dá)量分別為SS種群的16.77、6.29、4.82和12.86倍。進(jìn)一步比較了這4個(gè)基因在田間兩個(gè)抗性種群BZ和XJ體內(nèi)的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，CYP4-like2-Ag和CYP6-like3-Ag兩個(gè)基因在 BZ和XJ種群中的mRNA表達(dá)量較高，其中，CYP4-like2-Ag基因分別為SS種群的的6.05和4.74倍；CYP6-like3-

10、Ag基因分別為SS種群的4.97和3.07倍。但CYP4-like4-Ag和CYP6-like1-Ag兩個(gè)基因在BZ和XJ兩個(gè)種群體內(nèi)的mRNA表達(dá)量與SS種群差異不大。
　　采用RACE技術(shù)，成功克隆到棉蚜的P450基因CYP6-like3-Ag，其中RS和SS種群全長(zhǎng)均為1386 bp，含有全部的CDS序列，編碼區(qū)為1266 bp，共編碼456個(gè)有效氨基酸殘基，5’和3’非編碼區(qū)為13bp和107 bp，起始密碼子為ATG，終

11、止密碼子為TAA，預(yù)測(cè)分子量為53.112 kDa。根據(jù)國(guó)際P450命名委員會(huì)的命名規(guī)則命名為CYP6CY3。
　　利用pFastBac載體，進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建CYP6CY3的重組質(zhì)粒，運(yùn)用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，體外成功表達(dá)了棉蚜的CYP6CY3基因。測(cè)定了表達(dá)產(chǎn)物對(duì)模式底物（PNOD）的氧化代謝作用，結(jié)果表明，以PNOD（對(duì)硝基苯甲醚）為底物測(cè)得蛋白活性為8.60 mOD/min/mgprotein。采用LC-