基于MIGS的水稻高效基因沉默體系建立及應(yīng)用研究.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約二分之一以上的人口以稻米為主食，因此提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)尤為重要。隨著水稻基因組測(cè)序工作的完成，水稻功能基因組學(xué)已經(jīng)成為水稻科研工作的重心，從而發(fā)展出多種用于基因功能分析鑒定的新技術(shù)。其中RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）作為反向遺傳學(xué)研究的重要方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各物種的基因功能研究。
　　在植物中有一類稱為反式作用小干擾RNAs（trans-acting siR

2、NA，ta-siRNA）的特殊micro-RNAs（miRNAs），它能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的小分子干擾RNAs（small interfering RNAs， siRNA）從而導(dǎo)致目的基因沉默。miRNA介導(dǎo)的基因沉默（miRNA-induced gene silencing，MIGS）技術(shù)就是利用了miR173來介導(dǎo)tasiRNA的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的沉默。
　　MIGS技術(shù)在2012年首次報(bào)道能夠有效介導(dǎo)擬南芥目標(biāo)基因的沉默

3、，但是這一高效的基因沉默技術(shù)至今仍沒有得到有效的應(yīng)用，MIGS技術(shù)是否可以用于單子葉植物的研究更沒有相關(guān)報(bào)道。因此本研究基于MI GS工作原理，綜合考慮單子葉植物表達(dá)形式，構(gòu)建了miR173和miR173_ts不同表達(dá)模式的MIGS骨架載體pZHY930、pZHY931和pZHY932。首先選取水稻OsPDS為報(bào)告基因，通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因白化水稻植株。結(jié)果顯示三個(gè)骨架載體都能介導(dǎo)目標(biāo)基因的沉默，再生出白化水稻植株，其中p ZH9

4、32的沉默效率最高（達(dá)到90％），再生產(chǎn)生的白化植株目的基因OsPDS的RNA表達(dá)水平明顯降低。然后我們又選取了OsROC5和OsLZAY1兩個(gè)基因進(jìn)行MIGS沉默效應(yīng)，成功獲得了水稻葉片卷葉及分蘗角度增大的水稻突變體植株。再次，我們以pZHY932為骨架載體，構(gòu)建了OsPDS和OsROC5同時(shí)沉默，以及OsPDS和OsLZAY1同時(shí)沉默的雙基因沉默載體，獲得了白化卷葉和白化分蘗角度增加的雙突變體水稻植株，從而在水稻中建立了MIGS高效

5、基因沉默體系。
　　基于我們建立的在水稻中高效基因沉默技術(shù)——MIGS技術(shù)體系，針對(duì)水稻淀粉合成過程中負(fù)責(zé)合成直鏈淀粉的OsGBSS基因，構(gòu)建了MIGS-OsGBSS載體，并進(jìn)行了水稻遺傳轉(zhuǎn)化。以期利用MIGS技術(shù)沉默OsGBSS基因，對(duì)水稻淀粉合成途徑進(jìn)行有效表達(dá)調(diào)控，獲得高支鏈淀粉。
　　總之，本文基于 MIGS技術(shù)體系構(gòu)建了水稻 MIGS骨架載體。并且利用該骨架載體，選取水稻內(nèi)源基因，構(gòu)建了 MIGS-OsPDS、MI