神農(nóng)架金絲猴源益腸道益生菌的篩選和鑒定.pdf

1、川金絲猴（Rhinopithecus roxellanae）是中國(guó)特有的珍稀物種，我國(guó)Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，湖北省神農(nóng)架地區(qū)是川金絲猴生活的的最東端。由于消化道疾病是金絲猴常發(fā)疾病之一，且消化道疾病是導(dǎo)致幼猴死亡的主要原因，因此，維持金絲猴腸道微生態(tài)平衡，減少金絲猴消化道疾病的發(fā)生，對(duì)金絲猴個(gè)體健康和種群復(fù)壯具有重要意義。
　　本研究以神農(nóng)架金絲猴為研究對(duì)象，通過(guò)采集野生金絲猴的糞便300份，MRS培養(yǎng)基共分離到92株兼性乳酸菌，92株菌

2、發(fā)酵液上清對(duì)病原指示菌均有抑菌活性，但各菌株之間抑菌差異性較大。其中抑菌效果最明顯的是dlt6a、dlt6b、dlt6c、dlt7a、dlt7b、dlt9、dlt10a和dlt10b共8株菌。對(duì)該8株菌進(jìn)行屬、種的鑒定，鑒定結(jié)果表明分離的8株菌均為糞腸球菌。16SrRNA基因序列擴(kuò)增測(cè)序，腸球菌種特異性片段ddlE.faecalis、dE.faecium擴(kuò)增檢測(cè)，進(jìn)一步確證8株分離細(xì)菌為糞腸球菌。
　　對(duì)分離的糞腸球菌進(jìn)行安全性評(píng)

3、價(jià)，包括抗生素耐藥性檢測(cè)和毒力因子檢測(cè)，減少菌株存在的潛在危險(xiǎn)性。毒力因子的檢測(cè)方式為PCR擴(kuò)增cylA、esp、gelE、agg、efaAfs、ace、efaAfm等基因片段，PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果為:dlt6a為agg+esp+efaAfs+;dlt6b有agg+esp+efaAfs+;dlt6c為agg+esp+efaAfs+;dlt7a為esp+efaAfs+;dlt7b為esp+efaAfs+;dlt9為agg+cylA+esp+

4、efaAfs+;dlt10a為agg+cylA+efaAfs+;dlt10b為agg+esp+efaAfs+。綜合抑菌試驗(yàn)和毒力因子分析，選擇dlt7a、dlt7b和dlt10a為后續(xù)試驗(yàn)菌株?？股乜剐詸z測(cè)結(jié)果證明:dlt7a、dlt7b、和dlt10a對(duì)氨芐西林、紅霉素、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、壯觀霉素、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、氯霉素和慶大霉素敏感;而對(duì)青霉素、四環(huán)素表現(xiàn)耐藥，與腸球菌固有耐藥的類型相符。動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)從體態(tài)特征

5、觀察、細(xì)菌易位、臟器指數(shù)和臟器組織形態(tài)學(xué)方面考察分離菌株對(duì)動(dòng)物機(jī)體的安全性，結(jié)果表明糞腸球菌dlt7a和dlt7b是安全的菌株，dlt10a存在潛在危險(xiǎn)性。
　　為篩選能夠成為機(jī)體腸道優(yōu)勢(shì)菌群的菌株，本試驗(yàn)從菌株生長(zhǎng)速度、耐受能力（腸道膽鹽高滲透壓、胃酸低pH值等）以及耐高溫能力等方面評(píng)價(jià)分離的菌株。結(jié)果表明，兩株糞腸球菌（dlt7a和dlt7b）具有以下特點(diǎn):(1)能耐受pH2.5的酸性環(huán)境保持活菌數(shù)基本不變;(2)能耐受0.5