神農(nóng)架金絲猴常見病流行病學(xué)初步研究.pdf

1、川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）為我國(guó)特有物種，國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》和世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）分別將川金絲猴列為瀕危物種(E)和易危物種(VU)。湖北神農(nóng)架是我國(guó)川金絲猴地理分布的最東緣，只有1200多只，其中神農(nóng)架大龍?zhí)队幸吧鸾z猴（人工補(bǔ)食群）約80只;小龍?zhí)队谢\養(yǎng)猴（野外救治個(gè)體）9只，生存狀態(tài)極度瀕危。
　　疾病問題是危害和威脅金絲猴種質(zhì)資源保護(hù)的重大問題之一。因此對(duì)神

2、農(nóng)架金絲猴常見病進(jìn)行流行病學(xué)初步研究具有重要意義。
　　本研究主要包括對(duì)神農(nóng)架大龍?zhí)逗托↓執(zhí)督鸾z猴結(jié)核、致瀉性病原菌、B病毒和猴巨細(xì)胞皰疹病毒等猴常見重大病原微生物進(jìn)行病原學(xué)或血清流行病學(xué)調(diào)查，并建立了猴結(jié)核IFN-γ檢測(cè)方法。
　　1.猴結(jié)核IFN-γ體外釋放檢測(cè)法的建立與初步應(yīng)用傳統(tǒng)猴結(jié)核檢測(cè)方法為結(jié)核菌素眼瞼皮內(nèi)注射檢測(cè)法（簡(jiǎn)稱皮試），具有特異性差、對(duì)猴體刺激大、操作時(shí)間長(zhǎng)、不可追溯等缺點(diǎn)。本研究旨在建立猴結(jié)核IFN-

3、γ體外釋放檢測(cè)法，用于猴結(jié)核病的特異性診斷。運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室保存的原核表達(dá)的獼猴IFN-γ重組蛋白免疫Balb/C小鼠，再利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得12株高效價(jià)的單克隆抗體;同時(shí)免疫日本大耳白兔獲得獼猴IFN-γ抗血清，經(jīng)純化后得到高效價(jià)獼猴IFN-γ多克隆抗體。首先用所獲得的鼠抗IFN-γ單克隆抗體及兔抗IFN-γ多克隆抗體建立了檢測(cè)獼猴IFN-γ的夾心ELISA，檢測(cè)重組獼猴IFN-γ的靈敏度達(dá)到62.50pg/mL。該IFN-γ檢測(cè)法與進(jìn)

4、口商品化試劑盒的總體符合率為93.84％，κ=0.7800，表明具有較好的一致性。以眼瞼皮試法為參考方法，先用皮試法檢測(cè)146只獼猴，再用進(jìn)口商品化的IFN-γ檢測(cè)試劑盒檢測(cè)獼猴外周血淋巴細(xì)胞在牛和禽結(jié)核菌素刺激下釋放的IFN-γ量，利用ROC曲線確定獼猴結(jié)核IFN-γ檢測(cè)法的臨界值為114.5pg/mL，對(duì)皮試法的靈敏性為68.18％，特異性為91.94％。
　　應(yīng)用本研究所建立的獼猴IFN-γ檢測(cè)法對(duì)10份神農(nóng)架金絲猴血液樣本

5、進(jìn)行檢測(cè)，凝集素刀豆蛋白ConA刺激的全血樣本產(chǎn)生的IFN-γ濃度為1512±166.0pg/mL，與獼猴樣本產(chǎn)生的IFN-γ水平類似(獼猴產(chǎn)生的IFN-γ濃度為1050±278.0pg/mL)，表明本方法可以用于金絲猴結(jié)核病的檢測(cè)。10份金絲猴臨床樣本經(jīng)牛結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素刺激的全血樣本與陰性對(duì)照全血樣本產(chǎn)生的IFN-γ濃度無差別，表明10只金絲猴結(jié)核病均為陰性。總之，該研究建立了猴結(jié)核IFN-γ體外釋放檢測(cè)法，在獼猴結(jié)核檢測(cè)中進(jìn)行

6、了初步應(yīng)用，并可望用于金絲猴結(jié)核病檢測(cè)，從而為猴結(jié)核檢測(cè)提供了新型技術(shù)手段。
　　2.神農(nóng)架金絲猴糞便中致瀉性病原的分離鑒定本研究旨在對(duì)從神農(nóng)架采集的38只金絲猴的76份糞便樣品（包括8份腹瀉樣品）進(jìn)行致瀉性病原鑒定，包括致瀉性大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌等。結(jié)果從2只腹瀉猴樣本中鑒定出兩株致瀉性大腸桿菌，沙門氏菌和志賀氏菌未檢出。對(duì)所分離細(xì)菌進(jìn)行了培養(yǎng)特性和形態(tài)特征觀察及生化試驗(yàn)，進(jìn)一步開展了一系列檢測(cè)，如PCR分群、毒力相關(guān)基

7、因檢測(cè)、O抗原鑒定、LD50試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等。PCR分群結(jié)果表明，分離得到的兩株菌屬于大腸桿菌D群;PCR擴(kuò)增出eae(482bp)、escV(544bp)等毒力基因，確定所分離菌株為非典型腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。對(duì)aEPEC進(jìn)行分型鑒定，擴(kuò)增出黏附素β(562bp)基因，表明兩株分離株為黏附素β亞型;分離得到的菌株血清型均為O98;兩株分離菌株對(duì)小鼠致死性較弱，LD50分別為1.130×108CFU和5.260×107CFU。

8、藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，兩株菌都對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類和磺胺類等抗生素敏感。在第三代頭孢中，大腸桿菌應(yīng)該對(duì)頭孢噻肟和頭孢他啶耐藥敏感，但檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離株對(duì)這兩種藥耐藥。此外，其中菌株1對(duì)亞胺培南和美洛培南耐藥，而菌株2對(duì)其敏感。以上結(jié)果表明，此次神農(nóng)架金絲猴腹瀉可能是由非典型腸致病性大腸桿菌引起的，其中一株菌已具有一定的耐藥性。研究結(jié)果為金絲猴腹瀉性疾病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。
　　3.神農(nóng)架金絲猴常見病毒病血清流行病學(xué)初步調(diào)查本研究旨在

9、對(duì)神農(nóng)架小龍?zhí)?只籠養(yǎng)猴和大龍?zhí)?只野生猴血清進(jìn)行猴常見9種病毒抗體檢測(cè)，包括B病毒(BV)、猴T細(xì)胞趨向性病毒(STLV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)、猴泡沫病毒(SFV)、猴巨細(xì)胞病毒（RhCMV）、猴水痘病毒(SVV)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)和甲肝病毒(HAV)。結(jié)果，10只金絲猴中有6只猴B病毒IgG抗體陽性，感染率為60％(6/10);2只猴巨細(xì)胞病毒(RhCMV)抗體陽性，感