農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中反硝化細菌的多樣性研究.pdf

1、堆肥化用于處理農(nóng)業(yè)廢物已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但由于堆肥化過程中氮素的損失會產(chǎn)生臭氣并導致堆肥產(chǎn)品質(zhì)量下降，研究堆肥過程中氮素的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化規(guī)律具有重要的實際意義。反硝化作用也稱硝酸鹽呼吸，是在缺氧條件下，反硝化細菌通過一系列的酶催化還原反應(yīng)將氮氧化合物NO3-，NO2-還原成氣態(tài)氮(NO、N2O、N2)，在氮素循環(huán)過程中起著重要的作用。在農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥過程中，將反硝化作用作為切入點，通過對堆肥體系中環(huán)境因子的檢測以及利用分子生物學的方法對

2、反硝化細菌進行研究，分析他們的多樣性及與環(huán)境因子之間存在的關(guān)系，可以為減少氮素損失、堆肥工藝的優(yōu)化提供理論指導。
　　參與反硝化過程的四種反硝化基因分別為Nar、Nir、Nor、Nos，每種基因分別編碼對應(yīng)的一種還原酶:硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶。其中亞硝酸還原酶（Nir）將NO2-還原成NO的過程是反硝化過程中第一個產(chǎn)生氣體的關(guān)鍵步驟，亞硝酸還原酶有2種不同的結(jié)構(gòu)形態(tài):其中一種酶由含銅基(Cu-n

3、ir)的nirK基因編碼，另一種由含有亞鐵血紅素c和d1(cd1-nir)的nirS基因編碼。本研究模擬農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥過程，采用稻草秸稈等原料，使用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)研究了堆肥化過程中反硝化細菌nirK和nirS基因的種群動態(tài)變化特征。反硝化細菌nirK和nirS基因在整個堆肥進程中均有存在，克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明，nirK基因主要集中干Alcaligenaceae、Phyllobact

4、eriaceae、Bradyrhizobiaceae、Rhizobiaceae、Rhodobacteraceae和Brucellaceae6個屬。nirS基因主要屬于Pseudomonadaceae和Rhodocyclaceae這兩大屬。兩種反硝化還原酶基因的DGGE圖譜顯示，nirK和nirS基因的多樣性指數(shù)在堆肥的不同時期數(shù)值都不同，多樣性指數(shù)在堆肥升溫期和高溫期達到最大，在第15天降到最低值。15d后，兩種基因的多樣性指數(shù)緩慢增加

5、，堆肥后期，多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定。
　　在堆肥期間的不同時間進行取樣，對pH、堆體溫度、NH4+-N、NO3--N環(huán)境因子進行監(jiān)測。結(jié)果表明，堆肥期間出現(xiàn)了62℃的高溫，且高溫期持續(xù)了8d，滿足了達到堆肥腐熟的條件和衛(wèi)生學指標;此次堆肥過程pH整體在7.15～9.45之間波動，至堆肥完成時呈堿性，有利于微生物有效的發(fā)揮作用;在堆肥前期NH4+-N含量迅速上升，在第5天時含量至最高2122.20mg·kg-1（干樣計算），之后其含量呈

6、持續(xù)降低;而NO3--N的含量在堆肥才開始不久時有明顯的增加，3d～12d之間漸漸呈下降趨勢，其含量整體都處于一個相對低的水平，但在堆肥中后期時，其含量又慢慢增加，一直到堆肥完成時，其含量為1401mg·kg-1（以干樣計）。從以上各個環(huán)境因子的監(jiān)測情況來看，我們在實驗室成功地模擬了農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥的全過程。
　　對反硝化細菌nirK和nirS基因DGGE圖譜去除背景噪音后進行條帶匹配分析，以條帶在不同泳道中亮度峰值的百分含量構(gòu)建

7、反硝化細菌nirK和nirS基因的物種組成矩陣。將監(jiān)測得到的堆體溫度、pH、含水率、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等4個過程因子進行標準化后構(gòu)造環(huán)境因子矩陣，以去除因子量綱不同對后續(xù)多元分析的干擾。使用Canoco4.5軟件對獲得的反硝化細菌nirK和nirS基因種群數(shù)據(jù)與堆肥過程因子進行冗余分析。結(jié)果顯示，這些過程因子分別解釋了81.1％和70.2％的nirK和nirS種群的變化。nirK和nirS基因種群組成的動態(tài)變化均與堆體溫度、pH顯著相關(guān)。堆