豬源致病性大腸桿菌生物膜建模及常用抗菌藥物和木糖醇對(duì)生物膜的體外作用研究.pdf

1、仔豬大腸桿菌病可導(dǎo)致仔豬腹瀉、增重減緩、生長(zhǎng)抑制甚至僵豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該病多由致病性大腸桿菌引起，據(jù)報(bào)道，新生仔豬腹瀉由致病性大腸桿菌引起的占45％以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他病原。當(dāng)形成生物膜時(shí)，生物膜為大腸桿菌提供了一種保護(hù)性生活環(huán)境，提高了其耐藥性。本試驗(yàn)研究在體外條件下構(gòu)建仔豬大腸桿菌生物膜的適宜方法，在此基礎(chǔ)上對(duì)比浮游大腸桿菌與生物膜菌的耐藥情況。最后，考察木糖醇抑制細(xì)菌對(duì)生長(zhǎng)載體表面的粘附作用，從而干擾生物膜的形成，并探

2、討其與氟喹諾酮類藥物聯(lián)用時(shí)對(duì)生物膜的體外干擾作用，旨在為仔豬生物膜大腸桿菌的耐藥性及臨床上更合理地治療仔豬生物膜大腸桿菌感染提供科學(xué)依據(jù)。
　　1、通過卡爾加里生物膜發(fā)生裝置（Calgary Biofilm Device， MBEC）摸索不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間和不同濃度葡萄糖對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響，篩選出理想條件，建立大腸桿菌生物膜模型，此模型適用于定量檢測(cè)。然后采用上一步篩選出的條件，在內(nèi)置有3種不同材質(zhì)（聚氯乙烯薄片、硅

3、膠薄片和普通蓋玻片）載體片的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，采用光學(xué)顯微鏡觀察比較不同載體上細(xì)菌生物膜的形態(tài)，構(gòu)建生物膜形成模型，可用于定性分析。
　　2、采用MBEC生物膜發(fā)生裝置，應(yīng)用結(jié)晶紫染色法對(duì)120株臨床分離的致仔豬腹瀉的大腸桿菌生物膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　3、采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)頒布的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用MBEC微量稀釋法測(cè)定臨床分離大腸桿菌生物膜菌、浮游菌和脫膜菌對(duì)氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等19種

4、抗菌藥物的敏感性(MIC，MBC)。
　　4、通過平板菌落計(jì)數(shù)法和激光掃描共聚焦顯微鏡，考察0.5％、2.5％、5％木糖醇對(duì)大腸桿菌的抗粘附作用。
　　5、在0.5％、2.5％、5％的木糖醇對(duì)仔豬大腸桿菌生物膜形成進(jìn)行干預(yù)以及對(duì)細(xì)菌成熟生物膜進(jìn)行破壞后，檢測(cè)氟喹若酮類藥物對(duì)生物膜大腸桿菌的最小抑菌濃度(MBIC)和最小殺菌濃度(MBEC)。
　　結(jié)果表明:
　　1、采用MBEC和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，LB培養(yǎng)基，37

5、℃，PVC材料作為載體片，培養(yǎng)6天后可得成熟的大腸桿菌生物膜，成功構(gòu)建了體外仔豬大腸桿菌生物膜模型。
　　2、應(yīng)用建立的MBEC定量模型，對(duì)省內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)120株致病性大腸桿菌進(jìn)行生物膜形成能力檢測(cè)，結(jié)果顯示，生物膜形成率高達(dá)83.3％(100/120)。
　　3、相應(yīng)的浮游菌相比，臨床上常用的19種抗菌藥物對(duì)生物膜大腸桿菌的最低抗菌濃度(MBIC)和最低殺菌濃度(MBEC)高2-32倍。此外，浮游菌和通過超聲處理獲得的脫膜

6、菌對(duì)同種抗菌藥物的敏感性（無論是MIC，還是MBC）幾乎相同。
　　4、與陽性對(duì)照(＞500)相比，經(jīng)0.5％、2.5％、5％木糖醇處理后的菌落數(shù)（分別為160±23、236±32、387±24）均表現(xiàn)出顯著差異性(P＜0.05)。不同濃度木糖醇組之間兩兩比較，其菌落數(shù)也均有顯著差異(P＜0.05)，提示木糖醇對(duì)細(xì)菌的抗粘附作用呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。其次通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用木糖醇處理過的載體片細(xì)菌生物膜數(shù)量明顯減少，且0

7、.5％木糖醇處理后生物膜數(shù)量最少，即抗粘附效果最強(qiáng)。
　　5、不同濃度的木糖醇對(duì)仔豬大腸桿菌生物膜形成干預(yù)作用試驗(yàn)中，經(jīng)過0.5％、2.5％、5％木糖醇處理后的生物膜與無木糖醇處理組相比，環(huán)丙沙星和恩諾沙星的MBIC以及MBEC均顯著降低(P＜0.05），當(dāng)木糖醇濃度為0.5％時(shí)，聯(lián)合用藥增效最強(qiáng)。不同濃度木糖醇對(duì)仔豬大腸桿菌成熟生物膜的破壞試驗(yàn)中，經(jīng)過0.5％、2.5％、5％木糖醇后的生物膜與無木糖醇處理組相比，環(huán)丙沙星和恩諾沙

8、星的MBIC以及MBEC也顯著降低(P＜0.05)，表明木糖醇對(duì)氟喹諾酮類藥物具有增效作用，當(dāng)木糖醇濃度為0.5％時(shí)，聯(lián)合用藥增效最強(qiáng)。
　　本研究探討不同因素對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響，成功構(gòu)建大腸桿菌生物膜模型，模型穩(wěn)定性高，操作簡(jiǎn)便;豬源致病性大腸桿菌臨床分離株形成生物膜后耐藥性顯著增高，常用抗菌藥物單獨(dú)使用及與木糖醇聯(lián)合應(yīng)用可干擾該菌生物膜的形成和破壞已經(jīng)形成的生物膜。本研究結(jié)果對(duì)于今后進(jìn)一步開展體內(nèi)大腸桿菌生物膜感染防治