陸地棉TM-1第12部分同源染色體BAC重疊群構建.pdf

1、棉花是世界上重要的天然纖維和油料作物。完成棉花的基因組測序及密碼解析將為棉花的遺傳改良提供重要的數(shù)據(jù)資源和平臺，有助于科研人員從分子水平上更深入的了解棉花纖維的生長、發(fā)育機理，并對棉花新品種的培育及提高棉花的產量、品質和抗病性等具有重要的戰(zhàn)略意義。陸地棉TM-1是異源四倍體棉。異源四倍體棉種（AADD）是由A亞組和D亞組組成的，基因組比較大、重復序列高以及部分同源染色體基因組結構復雜的特征揭示著四倍體基因組的測序難度大。基于細菌的插入大

2、片段克隆的全基因組物理作圖，已經成為基因組研究中非?；钴S的領域。DNA指紋圖譜對于基于細菌的大片段插入克隆的大規(guī)模分析和產生基于克隆的全基因組物理圖譜，已被證明是有效的方法。DNA指紋圖譜與細菌中DNA大片段克隆技術相結合，已經成為利用插入大片段克隆進行全基因組物理作圖研究中最為廣泛使用的方法。
　　 棉花的物理圖譜是基因組研究的基礎，它不僅在研究基因組組織結構和棉種的起源進化方面具有重要的理論和應用價值，對棉花基因組的測序，重

3、要基因的圖位克隆以及大范圍的基因組分析也有重要意義。繪制高分辨率的物理圖譜是進行測序工作的保證。本研究以陸地棉遺傳標準系TM-1的BAC文庫及高密度遺傳圖譜為基礎，進行了陸地棉TM-1第12部分同源染色體重疊群構建，旨在為重要功能基因的圖位克隆和棉花基因組測序提供強有力的框架圖。主要研究結果如下:
　　 1、陸地棉A12和D12染色體是比較重要的一對部分同源染色體，目前許多與重要農藝性狀相關的基因已被定位在這兩條染色體上如無腺體

4、基因（gl2，gl3），纖維有無基因（N1，F(xiàn)b1，n2），核不育基因（ms5，ms6），致死基因（Le1，Le2）等。為了圖位克隆這些重要的農藝性狀相關的基因，需要構建這兩條染色體的物理圖譜。以本實驗室的高密度遺傳圖譜A12染色體上的54對標記和D12染色體上的48對標記進行TM-1BAC文庫的篩選，A12染色體上25對標記篩到了216個陽性單克隆，D12染色體上18對標記篩到了189個陽性單克隆，篩選到的陽性單克隆總數(shù)為405個。各

5、個標記篩到的陽性單克隆數(shù)從1到22個。結合本實驗室原有的基礎381個陽性單克隆，將686個陽性單克隆進行純化和BAC質粒DNA的提取，進行HindⅢ酶切，利用瓊脂糖方法進行酶切指紋圖譜的分析，通過Image3.10b軟件對瓊脂糖圖片進行分析，A12染色體上得到了387個單克隆的5，372條帶，D12染色體上得到了388個單克隆的4，843條帶，所獲得的bands文件通過FPCV9.3軟件的分析，將A12染色體的BAC單克隆和D12染色體

6、的BAC單克隆分開構建了A12和D12染色體的重疊群。其中A12染色體的各個引物的重疊群有77個，其contig長度在53-155kb之間，連續(xù)的contig有4個，大小在277kb-5，007kb之間;D12染色體上各個引物的重疊群有82個，其contig長度在61-119kb之間，連續(xù)的重疊群有7個，大小在81kb-2，407kb之間。
　　 2、多倍體植物測序的難點是如何有效的將部分同源染色體區(qū)分開來。針對這一難點，我們選

7、取了極具代表性的7組A12染色體和D12染色體共有的標記:NAU2715-180和NAU2715-250, NAU3441-230和NAU3441-180, NAU1151-160和NAU1151-170, NAU3293-180和NAU3293-150, NAU2251-165和NAU2251-155,NAU1237-255和NAU1237-150，NAU2356-150和NAU2356-170。由于異源四倍體棉種是由A亞組和D亞組組

8、合而成的，因此在利用這7組引物擴增時通常會出現(xiàn)兩個等位位點，即在海島棉Hai7124和陸地棉TM-1中均產生兩個等位位點。A12和D12染色體存在有共有標記，這證明了兩條染色體部分同源，而A12和Dt2染色體上的共有標記能夠篩選到相同的單克隆進一步的說明了A12和D12染色體部分同源，因此進行陽性單克隆的重疊群組裝前必須進行A12和D12染色體的區(qū)分，將來源于A12和D12染色體的單克隆區(qū)分開構建重疊群。7組標記所共有的陽性單克隆進行目

9、標引物的PCR擴增，根據(jù)帶型來進行A12和D12染色體的區(qū)分，其中來源于NAU2715-180(A12)的單克隆有3個，NAU2715-250(D12)的單克隆有6個;來源于NAU3441-230(A12)的單克隆有4個，NAU3441-180(D12)的單克隆有12個;來源于NAU1151-160(A12)的單克隆有2個，NAU1151-170(D12)的單克隆有2個;來源于NAU3293-180(A12)的單克隆有1個，NAU329

10、3-150(D12)的單克隆有4個;來源于NAU2251-165(A12)的單克隆有1個，NAU2251-155(D12)的單克隆有3個;來源于NAU1237-255(A12)的單克隆有3個，NAU1237-150(D12)的單克隆有4個;來源于NAU2356-150(A12)的單克隆有10個，NAU2356-170(D12)的單克隆有6個。對這些單克隆進行酶切指紋圖譜分析，分開構建了A12和D12染色體上相應的標記的contig，其中

11、NAU1151 A12和D12染色體上的contig長度分別是94kb，73kb; NAU1237 A12和D12染色體上的contig長度分別是102kb，73kb; NAU2356 A12和D12染色體上的contig長度分別是159kb，111kb; NAU2715 A12和D12上的contig長度分別是77kb，131kb; NAU3293 A12和D12染色體上的contig長度是77kb和45kb; NAU3441 A12

12、和D12上的contig長度分別是86kb，90kb; NAU2251A12和D12上的contig長度是41kb和81kb。
　　 3、棉花基因組具有豐富的BAC文庫資源，是棉花基因組測序分析所必不可少的重要基礎。不同的參數(shù)得到的重疊群的結果是不同的，大量的BAC單克隆聚集在一起做重疊群的組裝分析所得到的結果不準確。我們將A12和D12染色體的BAC單克隆區(qū)分開來，分開構建出A12的1個重疊群和D12的1個重疊群;同樣將這些來

13、源于A12和D12染色體的BAC單克隆混合在一起，采用FPC軟件推薦的默認參數(shù)設置，把原來分屬2個重疊群的BAC單克隆能夠錯誤地組裝成1個重疊群。很顯然，采用低的參數(shù)設置所得到的重疊群有時是錯誤的，是由分別來源于A12和D12部分同源染色體的單克隆聚集在一起組裝成的。因此本研究提出了在做棉花部分同源染色體的重疊群構建工作時所采用的適宜的參數(shù)，為今后利用BAC資源進行棉花基因組測序分析提供一種新的參考方法。公差值(Tolerance)的設

14、置能夠告訴FPC兩條被認為是匹配的條帶的接近程度。截止點（Cutoff）的設置是用來控制兩個必需結合成為一個毗連群的克隆應該有多少重疊部分。通過對FPC軟件的Tolerance值和Cutoff值進行優(yōu)化設置，以達到有效區(qū)分A12染色體上單克隆構成的contig和D12染色體上的單克隆構成的contig。將7組標記所對應的BAC單克隆混合在一起進行重疊群的組裝，Tolerance=5或6，Cutoff值=1e-12，Tolerance=7

15、，8或9，Cutoff值=1e-11或1e-12，6組標記(NAU1151，NAU1237，NAU2715，NAU2251，NAU3293，NAU2356)分開構建了A12和D12染色體上的contig，Tolerance=10，Cutoff值=1e-11，5組標記(NAU1151，NAU1237，NAU2715，NAU2251，NAU2356)分開構建了A12和D12染色體上的contig: Tolerance=10，Cutoff值=