菲降解菌株的分離、特性研究及其在植物—微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬—菲復(fù)合污染土壤中的初步應(yīng)用.pdf

1、從江蘇省射陽縣某化工廠廢水處理池的活性污泥中分離到兩株菲降解菌株，分別命名為PHE-1和PHE-2，根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性和16SrRNA基因相似性分析，將PHE-1鑒定為鞘酯菌屬（Sphingobium sp.），將PHE-2鑒定為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）。兩株菌均在pH 6.0-9.0范圍生長良好，最適生長pH分別為7.0和8.0，最適生長溫度均為30℃。在以100mg/L菲為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，P

2、HE-1和PHE-2在18h內(nèi)對菲降解率分別為99.12％和99.56％。Cu2+濃度高于800mg/L，Cd2+濃度高于450mg/L會明顯抑制PHE-1對菲的降解，Cu2+濃度高于400mg/L，Cd2+濃度高于1000mg/L會明顯抑制PHE-2對菲的降解。對菌株P(guān)HE-2的菌落形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在高于300mg/L的Cd2+脅迫下，PHE-2菌落邊緣出現(xiàn)透明化，內(nèi)部出現(xiàn)絮狀沉淀，初步推測可能是其對Cd2+毒害的一種耐性反應(yīng)。

3、r>　　多環(huán)芳烴芳香環(huán)雙加氧酶是菲降解途徑中第一個酶，它決定降解反應(yīng)的起始。我們根據(jù)已報道的多環(huán)芳烴雙加氧酶α亞基基因（ahdA1b）設(shè)計引物從菌株P(guān)HE-1中克隆到長度為1.49kb的基因片段。測序結(jié)果表明，與Sphingomonas sp.ZP1(EU082776)、Sphingomonas sp.P2(AB091693)的ahdA1b的相似性分別為99％、97％。其它與ahdA1b相似度較高的菌株大多數(shù)都來自鞘酯菌科(Sphing

4、omonadaceae），顯示該基因在鞘酯菌科菌株中具有很強的保守性。通過SEFA-PCR的方法獲得了該基因片段上下游片段，拼按后的總長為9.1kb。Blast在線比對分析結(jié)果顯示其與Sphingomonas sp.P2芳香環(huán)化合物降解基因簇(GenBank Accession No.AB091693)的相似性為96％，它包含六個基因分別為xylA，xylM，ahdA2b，ahdA1b，ahdA2a和ahdA1a。
　　鄰苯二酚雙

5、加氧酶是菲降解過程中另外一個關(guān)鍵酶，它催化中間代謝產(chǎn)物的開環(huán)。根據(jù)已報道的鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶基因（xylE）設(shè)計引物，從PHE-1中擴增該基因。結(jié)果顯示，從PHE-1中克隆得到xylE基因(1188bp)，在線序列相似性比對顯示，該基因與Sphingomonas sp.B2-7中xylE(EU596533.2)的相似性為99％。
　　采用熒光定量PCR技術(shù)，研究了菲、Cd2+、Cu2+對菌株P(guān)HE-1中鄰苯二酚-2.3-雙

6、加氧酶基因（xylE）和多環(huán)芳烴雙加氧酶α亞基基因（ahdA1b）轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果顯示ahdA1b基因和xylE基因均為誘導(dǎo)型基因，菲誘導(dǎo)下ahdA1b基因的拷貝數(shù)要遠高于xylE基因的拷貝數(shù);在低濃度Cd2+、Cu2+(100mg/L)脅迫下xylE和ahdA1b的拷貝數(shù)高于對照中相對應(yīng)基因的拷貝數(shù)。在500mg/L Cd2+脅迫下，xylE和ahdA1b的拷貝數(shù)低于對照中相對應(yīng)基因的拷貝數(shù)，在500mg/L Ca2+脅迫下，xylE

7、和ahdA1b的拷貝數(shù)高于對照中相對應(yīng)基因的拷貝數(shù)。
　　利用黑麥草分別與PHE-1，PHE-2菌株建立植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系，分別對濃度為500mg/kg菲單一污染土壤、銅-菲復(fù)合污染土壤(菲和Cu2+濃度均為500mg/kg)以及電子垃圾土進行生物修復(fù)實驗。每克土壤中接種菌株1.5×107個，結(jié)果顯示，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)的效果明顯優(yōu)于微生物單獨修復(fù)的效果。在菲單一污染土壤中，接種PHE-1的土壤中的菲殘留濃度（種植黑麥草和

8、未種植黑麥草分別為101.9mg/kg、116.1mg/kg）和接種PHE-2的土壤中的菲殘留濃度(種植黑麥草和未種植黑麥草分別為86.9mg/kg、90.6mg/kg)均低于未接種功能菌株的土壤中的菲殘留濃度（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為150.3mg/kg、204.1mg/kg）;接種PHE-1的土壤中xylE基因的平均拷貝數(shù)（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為5.18×108copies/g、3.23×108copies/g）和接種

9、PHE-2的土壤中xylE基因的拷貝數(shù)（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為1.285×109copies/g、6.98×108copies/g）高于未接種功能菌株的土壤中xylE基因的拷貝數(shù)(種植黑麥草、未種植黑麥草分別為1.64×108copies/g和1.31×108copies/g)。在銅-菲復(fù)合污染土壤中，接種PHE-1的土壤中的菲殘留濃度（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為101.2mg/kg、115.7mg/kg）和接種PHE-2的

10、土壤中的菲殘留濃度(種植黑麥草和未種植黑麥草分別為140.8mg/kg、140.1mg/kg)均低于未接種功能菌株的土壤中的菲殘留濃度(種植黑麥草和未種植黑麥草分別為152.3mg/kg、204.2mg/kg);接種PHE-1的土壤中xylE基因的平均拷貝數(shù)（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為1.98×109copies/g、6.24×108copies/g）和接種PHE-2的土壤中xylE基因的拷貝數(shù)（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為7.2

11、7×108copies/g、4.01×108copies/g）高于未接種功能菌株的土壤中xylE基因的拷貝數(shù)（種植黑麥草和未種植黑麥草分別為2.1×108copies/g、1.08×108copies/g）。在電子垃圾土中，接種功能菌株土壤中與未接種功能菌株盆缽中土壤中菲殘留濃度以及xylE基因的拷貝數(shù)沒有明顯差異。對比銅-菲復(fù)合污染土壤的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)接種PHE-1的盆缽中的菌株降解效果要好于接種PHE-2的盆缽中菌株降解效果。