高效抗重金屬菌株的選育及其在生物修復(fù)鎘污染土壤中的應(yīng)用.pdf

1、生物強(qiáng)化技術(shù)作為生物修復(fù)重金屬污染土壤的一種手段，是近年來環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文利用誘變育種技術(shù)獲取了對(duì)鎘具有高耐受性和高富集性的誘變微生物；研究了添加一種工業(yè)廢棄物—諾沃肥，對(duì)誘變微生物在含鎘土壤中的生長以及固定土壤中鎘的促進(jìn)作用；在生物強(qiáng)化修復(fù)過程中，研究并優(yōu)化了影響修復(fù)效果的各個(gè)因素；并通過盆栽試驗(yàn)最終確認(rèn)了生物強(qiáng)化對(duì)鎘污染的修復(fù)效果。最后初步研究了利用基因組改組技術(shù)構(gòu)建高效抗鎘融合菌，考察了同時(shí)利用2株融合菌進(jìn)行生物強(qiáng)

2、化修復(fù)鎘污染土壤的效果。
　　 主要研究結(jié)果包括：(I)紫外線誘變和亞硝酸誘變技術(shù)均可以被用來選育高抗鎘微生物。以枯草芽孢桿菌Bacillus subtillis(鎘對(duì)其最小抑制濃度MIC=0.25mmol/L)為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外誘變5 min后，獲取的高效抗鎘誘變菌B38的MIC被提高到3 mmol/L，抗鎘性能是出發(fā)菌的12倍；以熱帶假絲酵母菌Candidatropicalis(對(duì)鎘的MIC=0.08 mmol/L)為出發(fā)

3、菌株，紫外誘變5 min獲得高抗Cd的誘變菌C14，對(duì)鎘的MIC被提高到1.2 mmol/L，抗鎘性能是出發(fā)菌的15倍。掃描電鏡圖譜、透視電鏡圖譜和傅立葉紅外圖譜分析表明，誘變菌株B38在吸附鎘后，表面可以吸附大量的鎘，并且細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的凹陷和質(zhì)壁分離，說明B38具有高效的抗鎘性能，另外，其細(xì)胞壁的組分中存在羥基、酰胺基、羰基等活性基團(tuán)，這些基團(tuán)參與了吸附固定鎘的反應(yīng)。(II)誘變菌株B38和C14對(duì)鎘的吸附能力受到很多因素的

4、影響。死體誘變菌株對(duì)鎘的吸附能力略強(qiáng)于活體菌株；當(dāng)溶液中鎘的起始濃度為0.5 mmol/L時(shí)，活體B38誘變菌在吸附鎘的最佳條件pH=7、菌齡=8 h、吸附時(shí)間-20 h和菌液初始濃度=1×107 cells/mL下，對(duì)鎘的吸附量達(dá)到2 mmol/g左右；活體C14誘變菌在吸附鎘的最佳條件pH=8、菌齡=14 h、吸附時(shí)間=24 h和菌液初始濃度=6×106 cells/mL下，對(duì)鎘的吸附量為1 mmol/g左右。兩個(gè)誘變菌株的吸附行為

5、都可以用Langmuir和Freundlich吸附等溫線描述，且更符合Freundlich吸附方程。(III)對(duì)諾沃肥固定鎘的機(jī)理研究表明，其含有大量的羥基，羰基和羧基、豐富的有機(jī)質(zhì)以及石灰，這些基團(tuán)起到了主要的作用；在添加諾沃肥后，染毒土壤浸提液，有利于誘變菌株B38和土著微生物的繁殖生長，細(xì)菌總數(shù)和誘變菌B38數(shù)目分別被提高了7倍和17倍，同時(shí)說明了B38和土著微生物存在協(xié)同生長，并且能有效的降低土壤溶液中鎘的濃度至1.78×10-

6、4 mmol/L。添加諾沃肥到土壤后可提高土壤的pH值、CEC含量以及有機(jī)質(zhì)和DOC含量，在進(jìn)一步接種B38后，pH值有所降低，表明生物強(qiáng)化對(duì)土壤pH值有一定的緩沖作用。(IV)添加諾沃肥可以有效降低土壤二乙烯三胺五乙酸(DTPA)可提取態(tài)鎘的量(E-Cd)，而生物強(qiáng)化(引入誘變微生物)可進(jìn)一步促進(jìn)鎘的固定效果，pH=7時(shí)，E-Cd分別降低了33％和72％。環(huán)境條件對(duì)于不同處理土壤的E-Cd有不同的影響規(guī)律，最適合生物強(qiáng)化修復(fù)的環(huán)境條件

7、為pH7、溫度30℃和土壤含水率50％。添加諾沃肥修復(fù)和生物強(qiáng)化修復(fù)的土壤中過氧化氫和脲酶活性明顯高于對(duì)照組，說明生物修復(fù)后，土壤酶活性已經(jīng)恢復(fù)。表明這2種修復(fù)措施都能改善土壤結(jié)構(gòu)和性能，提高土壤的肥力。(V)以諾沃肥和誘變菌B38制成的復(fù)合生物固定劑對(duì)鎘污染(10 mg/kg)土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)后，鎘對(duì)土壤上種植的胡蘿卜的發(fā)芽率沒有影響，60天后收獲的胡蘿卜可食部分干重與沒有經(jīng)過修復(fù)的含鎘土壤(對(duì)照)相比，增加了15.6倍；并且地下

8、部的鎘含量降低至0.15 mg/kg；土壤中酸可提取態(tài)鎘的含量降低了73％，氧化物結(jié)合態(tài)、有機(jī)結(jié)合態(tài)和殘余態(tài)鎘的含量有所增加，說明生物強(qiáng)化處理改變了土壤中鎘的各個(gè)形態(tài)的分布比例；變性凝膠梯度電泳(DGGE)圖譜結(jié)果顯示，經(jīng)過生物強(qiáng)化修復(fù)，土壤微生物群落的豐度最高。在鎘污染土壤上種植葉菜類蔬菜后，菠菜和小白菜可食部分鎘含量分別為3.42和1.01 mg/kg；經(jīng)過生物強(qiáng)化修復(fù)后，菠菜和小白菜可食部分的鎘含量分別降低至0.74 mg/kg和

9、0.16 mg/kg。綜上，3種蔬菜可食部分的鎘的含量均顯著降低，其中小白菜和胡蘿卜體內(nèi)鎘含量達(dá)到了國家無公害蔬菜質(zhì)量限量標(biāo)準(zhǔn)，但是種植菠菜時(shí)，存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性。(VI)基因組改組技術(shù)可以被用來構(gòu)造高效抗鎘微生物，通過3輪的基因組改組后，共獲取了2株抗鎘融合菌F178和F185，其MIC分別被提高至4mmol/L和4.2 mmol/L，表明2株融合菌對(duì)鎘的抗性比6株出發(fā)菌有顯著的提高；在生物強(qiáng)化修復(fù)鎘污染土壤的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分別接種這

10、2株融合菌在生物強(qiáng)化處理60 d后，可以顯著降低蘿卜體內(nèi)的鎘濃度至0.3和0.4 mg/kg，但是，如果同時(shí)利用F178和F185進(jìn)行生物強(qiáng)化處理時(shí)，蘿卜體內(nèi)鎘含量降至0.17 mg/kg。
　　 本論文利用紫外線誘變和亞硝酸誘變技術(shù)選育出對(duì)鎘具有高耐受性和高積累性的微生物，為篩選和培育修復(fù)重金屬污染的微生物提供了方法借鑒；以諾沃肥作為無害工業(yè)廢棄物的代表，提出了復(fù)合生物制劑配方，改善微生物生境，協(xié)同微生物對(duì)重金屬的固定效果，實(shí)