抗重金屬微生物的篩選及其抗鎘機(jī)理和鎘吸附特性研究.pdf

1、隨著重金屬污染日趨嚴(yán)重，污染治理已成備受關(guān)注的焦點(diǎn)。生物修復(fù)是頗具潛力的治理方法，應(yīng)用從污染區(qū)分離篩選的本土微生物能有效提高生物修復(fù)的效率。因此，研究本土抗重金屬微生物對修復(fù)重金屬污染有重要意義。
　　 本研究首先通過馴化、篩選和分離，從株洲冶煉廠的土壤中獲得一批抗鎘微生物。其中抗性最高的細(xì)菌和真菌分別是E1和M1，E1能在18 mmol/L，的固體培養(yǎng)基和10 mmol/L的液體培養(yǎng)基中生長，M1能80 mmol/L的固體培養(yǎng)

2、基和40 mmol/L，的液體培養(yǎng)基中生長?？规k菌株E1是革蘭氏陰性兩端鈍圓的短桿菌，有端生鞭毛，大小約0.5-1.0μm×2.0-3.0μm。在無鎘培養(yǎng)基中產(chǎn)生黃綠或藍(lán)綠色色素，在鎘濃度高于1 mmol/L，的培養(yǎng)基中一般不產(chǎn)生色素。菌株E1的生理生化特性與假單胞菌很相似。16S rDNA序列同源性分析表明菌株E1與GenBank中的銅綠假單胞菌(Pesudomonas aeruginosa)的同源性最高達(dá)98％?？蓪1初步鑒定為銅

3、綠假單胞菌。菌株M1菌絲體呈白色或淡紫色，掃描電鏡分析表明氣生菌絲有隔和分枝，分生孢子細(xì)長，長在氣生菌絲上，孢子呈橢圓形。通過18S rDNA、ITS和β-微管蛋白基因序列的分析，表明該菌與淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)同源性達(dá)99％以上，將M1初步鑒定為淡紫擬青霉菌。對抗鎘菌株E1和M1的抗性和生長條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，它們不僅具有抗鎘的能力，而且還對其它重金屬Zn、 Mn、Cu、Pb和Co以及多種抗生

4、素具有抗性。菌株E1和M1的適宜生長和抗鎘(2mmol/L)條件為溫度20-35℃，pH6-8，裝液量80-100 mL(250 mL搖瓶)。但是E1的生長和抗鎘最適pH值為7，而M1的為6，它們的最適溫度是30℃。50 mg/L的Zn和Mn能促進(jìn)或不因影響菌株的生長，而50 mg/L而Pb和Co對兩個(gè)菌株的生長和抗鎘都有抑制作用。
　　 其次，利用分子生物學(xué)技術(shù)初步研究了P.Aeruginosa E1的抗鎘機(jī)理。采用煮沸法、S

5、DS法和試劑盒提取P.Aeruginosa E1的質(zhì)粒，沒有得到結(jié)果；采用SDS、吖啶橙和苯甲酸鈉培養(yǎng)消除質(zhì)粒后測試菌株的抗鎘性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒消除前后的抗鎘性能沒有明顯差異。表明該菌株內(nèi)沒有質(zhì)粒，抗性基因存在染色體上。利用RT-PCR技術(shù)，對P.Aeruginosa E1中相關(guān)的基因在鎘脅迫下的表達(dá)差異進(jìn)行了研究，以了解菌株的抗鎘機(jī)理。在鎘脅迫1 h后czcA， czcB和czcC上調(diào)表達(dá)量達(dá)到最大，然后回落到一個(gè)相對穩(wěn)定的范圍。cz

6、cD卻在加入鎘離子10 min后表達(dá)量上調(diào)到最高值，達(dá)15.67倍，然后在1-4 h內(nèi)保持相對穩(wěn)定的范圍。czcD的表達(dá)量一般高于其他三個(gè)基因，在抗鎘中表現(xiàn)出很重要的作用。在鎘脅迫下，基因cysM的表達(dá)較cysK強(qiáng)，主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，而cysK的表達(dá)差異較小，表明鎘脅迫下由cysM編碼的O-乙酰絲氨酸裂解酶B在半胱氨酸的合成中起主要作用。Mgt體系對鎘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控反應(yīng)比較快，主要在鎘脅迫的前期起作用；znu轉(zhuǎn)運(yùn)體系的表達(dá)上調(diào)比較緩和

7、而持久。初步認(rèn)為鎘脅迫下菌株E1是通過外排鎘離子，增加半胱氨酸的合成來適應(yīng)環(huán)境的，znu和mgt體系“輪流”負(fù)責(zé)鎘離子的內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 同時(shí)，對抗鎘P.Aeruginosa E1和P.Lilacinus M1的鎘吸附作用進(jìn)行了初步探討。表明抗鎘菌株E1的活細(xì)菌和滅活細(xì)菌都對水環(huán)境中的鎘有明顯去除作用，吸附24 h后，活細(xì)菌的去鎘效果比滅活細(xì)菌好，吸附率分別為43.3％和22.6％。對M1在100 mg/L鎘離子培養(yǎng)基生長過程中

8、的吸附作用進(jìn)行了研究。在生長對數(shù)期，菌株對鎘離子的吸附率從8.09％增加到68.8％，該菌株在培養(yǎng)期3-4天的時(shí)候吸附效率最高。利用生物陶粒固定微生物進(jìn)行了鎘吸附試驗(yàn)， E1和M1最大吸附率可達(dá)42.36％和64.9％，搖瓶和反應(yīng)器吸附試驗(yàn)均表明固定菌體后的生物陶粒能有效的吸附溶液中的鎘離子；紅外光譜分析表明E1對鎘離子的吸附主要與C-O、C=O、C-H、O-H、C-N、N-H以及磷酸功能基團(tuán)有關(guān)，M1主要與C=O、C-H、N-H等有關(guān)

9、：能譜分析證實(shí)固定E1和M1的陶粒可以較好的吸附溶液中的鎘；M1菌絲體對鎘的吸附可能是通過分泌大量胞外多糖類物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的。
　　 此外，從污染土壤中還分離到一株抗汞菌株D2，通過分析它的16SrDNA序列，將其鑒定為P.aeruginosa。菌株D2能生長在60 mg/L Hg2+的固體培養(yǎng)基中，但在60 mg/L Hg2+的液體培養(yǎng)基中不能繁殖。對菌株D2的抗性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明它對其他的重金屬Cu、Co、Mn、Zn、Cd和