銀杏葉提取物對大鼠心肌梗死后心肌重塑相關ⅰ型膠原蛋白和tgf-β表達的影響

1、<p>　　《中國圖書資料分類法》分類號： 單位代碼：10660</p><p>　　R541.4 學 號：S100232</p><p><b>　　貴陽醫(yī)學院</b></p><p>　　2013屆碩士學位論文</p><p>　　銀杏葉提取物對大鼠心肌梗死后心肌重塑</p><p>

2、;　　相關Ⅰ型膠原蛋白和 TGF-β表達的影響</p><p>　　研 究 生： 張雅男</p><p>　　導 師： 劉興德教授</p><p>　　年 級： 2010級</p><p>　　專 業(yè)： 內(nèi)科學（心血管?。?lt;/p><p>　　2013年 05月 17日</p><p>　　20

3、13 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘 要 ?????????????? 3</p><p>　　前 言 ?????????????? 4</p><p>　　材料與方法 ???????????? 5</p><p>　　結 果 ??????

4、???????? 10</p><p>　　討 論 ??????????????15</p><p>　　結 論 ??????????????17</p><p>　　參考文獻 ?????????????18</p><p>　　英文摘要 ?????????????21</p><p>　　致 謝 ??????????

5、??? 22</p><p>　　縮略詞表??????????????23</p><p>　　論文原創(chuàng)性聲明 ?????????? 24</p><p>　　附：綜 述 ?????????????25</p><p><b>　　2</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文&l

6、t;/p><p>　　銀杏葉提取物對大鼠心肌梗死后心肌重塑相關Ⅰ型膠原蛋白和 TGF-</p><p><b>　　β表達的影響</b></p><p>　　專 業(yè) 內(nèi)科學（心血管?。?lt;/p><p><b>　　研究生 張雅男</b></p><p>　　導 師 劉興德 教授&

7、lt;/p><p><b>　　摘要：</b></p><p>　　目的：觀察銀杏葉提取物對大鼠心肌梗死后心肌重塑相關Ⅰ型膠原蛋白和 TGF-β</p><p><b>　　表達的影響。</b></p><p>　　方法：采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型。術后將存活</p>

8、;<p>　　鼠分為 6 組，每組 20 只：假手術組（A 組）、急性心肌梗死組（B 組）、急性心</p><p>　　肌梗死+阿司匹林干預組(C 組)、急性心肌梗死+卡托普利干預組（D 組）、急性</p><p>　　心肌梗死+高劑量銀杏葉提取物干預 4w 組（E4W 組）和 8w 組（E8W 組）、急性心</p><p>　　肌梗死+低劑量銀杏葉提

9、取物干預 4w 組（F4W 組）和 8w 組（F8W 組）。采用免疫</p><p>　　組化的方法檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達，采用 RT-PCR 檢測 TGF-β mRNA 的表達。</p><p>　　結果：1、于 4 周和 8 周時，與 A 組比較，B、C、D、E、F 組大鼠的Ⅰ型膠原</p><p>　　蛋白含量均顯著增高（P＜0.01）；與 B 組比較，C、D

10、、E、F 組大鼠心肌的Ⅰ型</p><p>　　膠原蛋白含量均顯著降低（P＜0.01）；于 8 周時，C、D、E、F 組的心?、裥湍z</p><p>　　原蛋白表達均顯著低于 4 周時（P＜0.05 or ＜0.01）。4w（8w）時，C、D、E、</p><p>　　F 組Ⅰ型膠原蛋白間比較，無統(tǒng)計學差異。2、于 4 周和 8 周時，與 A 組比較，</p&

11、gt;<p>　　B、C、D、E、F 組大鼠的 TGF-β mRNA 表達均顯著增高（P＜0.01）；與 B 組比</p><p>　　較，C、D、E、F 組大鼠心肌的 TGF-β mRNA 表達均顯著降低（P＜0.05）；于 8</p><p>　　周時，C、D、E、F 組的心肌的 TGF-β mRNA 表達均顯著低于 4 周時（P＜0.01）。</p>&l

12、t;p>　　4w（8w）時，C、D、E、F 組 TGF-β mRNA 間比較，無統(tǒng)計學差異。</p><p>　　結論：銀杏葉提取物能降低大鼠急性心肌梗死后與心肌重塑相關的Ⅰ型膠原蛋白</p><p>　　和 TGF-β mRNA 的表達。</p><p>　　關鍵詞：銀杏葉提取物 急性心肌梗死 轉(zhuǎn)化生長因子-β Ⅰ型膠原</p><p&g

13、t;<b>　　3</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　導致充血性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要原因是急性心肌梗死（acute myocardial</p><p>　　infarction,AMI）后發(fā)生的心肌重塑，心

14、肌重塑的嚴重程度與 AMI 后心力衰竭的</p><p>　　預后有直接關系[1-2]。因此，積極防治 AMI 后心肌重塑已成為目前醫(yī)學研究的熱</p><p><b>　　點。</b></p><p>　　轉(zhuǎn)化生長因子 β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）由一類結構和功</p><p&

15、gt;　　能相關的多肽生長因子組成，其中，最為重要的是 TGFβs。TGFβ 作為一個重要</p><p>　　的介質(zhì)參與了 AMI 后心肌重塑的發(fā)病機制。新近研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 的 T29-C</p><p>　　基因變化與 AMI 易感性相關[3]，AMI 后心肌中 TGF-β1 顯著增加，且濃度與組織</p><p>　　損傷的程度呈正相關。有研究表明[4

16、]，TGFβ 抑制劑可使左室重塑減弱，并能抑</p><p>　　制心臟肥大和減少心室非梗死區(qū)纖維化的發(fā)生。</p><p>　　膠原蛋白包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ五種。其中Ⅰ型膠原蛋白約占心肌膠原蛋</p><p>　　[5] 白總數(shù)的 51%，其決定著心肌收縮舒張的僵硬度。Behrami</p><p><b>　　等認為缺血性心肌

17、</b></p><p>　　病心肌重塑的主要因素是因為心肌梗死區(qū)發(fā)生了纖維化，當間質(zhì)膠原含量由正常</p><p>　　的 3％-5％增加至 8％-10％時，心室舒張順應性會下降，心室的最大充盈速率降</p><p>　　低、充盈壓隨之增加；當膠原含量增至 20％時，增生的膠原網(wǎng)包圍心肌細胞并</p><p>　　對其實行“封閉

18、”，使心肌收縮受限，力的傳遞也會受到阻礙，最終導致心臟的收</p><p>　　縮功能發(fā)生障礙，心臟射血分數(shù)和心博量下降。AMI 后膠原蛋白的代謝異常是</p><p>　　心室重塑機制的重要組份。AMI 后心肌膠原纖維，特別是Ⅰ型膠原的增多會影</p><p>　　響心肌的收縮功能，從而導致心力衰竭[6]。因此，設法在 AMI 后的心衰過程中</p>

19、<p>　　抑制Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，日益成為逆轉(zhuǎn)心室重塑和改善心力衰竭研究的熱點[7]。</p><p>　　銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract GBE）是從銀杏葉中提取的一種混合物，</p><p>　　具有獨特藥理活性，其中黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物[8-9] 是銀杏葉提取物的主要有</p><p>　　效成分。銀杏葉提取物具有擴張血管

20、，保護心臟的作用，對心臟缺血等有顯著的</p><p>　　療效，研究表明[10]，銀杏葉提取物能夠改善心肌缺血。本實驗擬以阿司匹林和</p><p>　　卡托普利為陽性對照，研究銀杏葉提取物對大鼠心肌梗死后心肌重塑相關Ⅰ型膠</p><p>　　原蛋白和 TGF-β表達的影響，為臨床科學防治 AMI 后心力衰竭提供基礎研究資</p><p>

21、;<b>　　料。</b></p><p><b>　　4</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　材料</b></p><p><

22、;b>　　實驗動物</b></p><p>　　120只清潔級 SD雄性大鼠，體重 200g～250g,購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實</p><p>　　驗動物中心，合格證號：SCXK(黔)2012-0003。</p><p><b>　　實驗儀器</b></p><p>　　外科手術器械 上海手術器械廠

23、生產(chǎn)</p><p>　　6851-K型心電圖機 日本生產(chǎn)</p><p>　　TGLL-18G臺式高速冷凍離心機 太倉市醫(yī)藥器械廠生產(chǎn)</p><p>　　HX-300動物呼吸機 成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)</p><p>　　WFZ-753型紫外可見分光光度計 長沙市湘計儀器有限公司生產(chǎn)</p><p>　　Sigm

24、a 3K30 低溫高速離心機</p><p>　　Stand Power Pack P25 電泳儀（Biometra）</p><p>　　ZD-9556 水平搖床（太倉市科教器材廠）</p><p>　　渦旋混勻器（中外合資深圳天南海北有限公司）</p><p>　　醫(yī)用低溫冰箱 北京京麗低溫設備公司生產(chǎn)</p><p&

25、gt;　　電熱恒溫培養(yǎng)箱 杭州匯爾儀器設備有限公司</p><p>　　日立 7600型自動生化監(jiān)測儀 日本日立公司生產(chǎn)</p><p>　　電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司</p><p><b>　　自制鼠臺</b></p><p><b>　　實驗器材</b></p>&l

26、t;p>　　器 材 名 稱 制 造 商</p><p>　　擴增儀（PE9700） PE Applied Biosysterms（USA）</p><p>　　核酸擴增實時熒光檢測系統(tǒng)（DA7600） 中山大學達安基因股份有限公司</p><p>　　超純水系統(tǒng)（MLTRA GE MK2） ELGA（UK）</p><p>　　全波長酶

27、標儀（Microplate Reader） Thermo SCIENTIFIC（USA）</p><p>　　顯微鏡（LEICA） OLYMPUS（Japan）</p><p>　　圖像采集系統(tǒng)（BX41） OLYMPUS（Japan）</p><p>　　pH儀（Five Easy） Mettler Toledo（USA）</p><p>

28、<b>　　5</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　超凈工作臺（SW-CJ-1FD） 蘇州凈化設備有限公司</p><p>　　Biomias圖像分析儀 四川大學圖像圖形研究所</p><p><b>　　實驗藥品及試劑</b></p>&l

29、t;p><b>　　大鼠灌胃所需藥品</b></p><p>　　銀杏葉提取物，批號：xp110128，由貴州省工程中心研究員提供，呈黃色粉</p><p>　　末，含量為總黃酮 26.03%（榭皮素 11.40%、山乃素 12.71%、異鼠李素 1.92%），</p><p>　　內(nèi)酯 6.25%（銀杏內(nèi)酯 C1.14%、白果內(nèi)酯 1.

30、64%、銀杏內(nèi)酯 A2.11%、銀杏內(nèi)酯</p><p><b>　　B1.09%）。</b></p><p>　　阿司匹林，阿拉丁試劑公司</p><p>　　卡托普利，湖北四環(huán)制藥有限公司</p><p>　　RT-PCR 所需試劑</p><p>　　TRIzol 試劑（Sigma 公司，保

31、存于 4℃）</p><p>　　RT-PCR 試劑盒（Takara 公司，保存于-20℃），制品內(nèi)容：</p><p>　　SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)(2×Conc.)</p><p>　　ROX Reference Dye(50×Conc.)</p><p>　　RO

32、X Reference Dye Ⅱ(50×Conc.)</p><p>　　引物（上海申工公司合成）</p><p>　　氯仿，異丙醇，無水乙醇，DEPC</p><p>　　免疫組織化學所需試劑</p><p>　　松節(jié)油，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司</p><p>　　無水乙醇，山東利爾康消毒科技股份有限公

33、司</p><p>　　95％乙醇，山東利爾康消毒科技股份有限公司</p><p>　　過氧化氫，貴州赤天化公司</p><p>　　牛血清白蛋白，MP Biomedicals 公司</p><p>　?、裥湍z原抗體，abcam 公司產(chǎn)品</p><p>　　即用型羊抗兔 SABC 二抗免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工

34、程有限公司</p><p>　　中性樹膠 Na2HPO4 NaCL KCL KH2PO4 Tris 堿 ，均購自武漢博</p><p>　　士德生物工程有限公司</p><p><b>　　6</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　實驗方

35、法</b></p><p>　　大鼠急性心肌梗死模型建立</p><p><b>　　實驗分組</b></p><p>　　120 只 SD 雄性大鼠，體重 200g～250g ，以結扎左冠狀動脈前降支的方法</p><p>　　制備急性心肌梗死模型，隨機分為假手術組（A 組）；模型組（B 組）；阿司匹林&l

36、t;/p><p>　　組 10mg/kg（C 組）；卡托普利組 20mg/kg（D 組）；銀杏葉提取物高劑量組 100mg/kg</p><p>　　（E 組），并再分為藥物連續(xù)灌胃 4w 組（E4w 組）和連續(xù)灌胃 8w 組（E8w 組）；</p><p>　　銀杏葉提取物低劑量組 50mg/kg（F 組），并再分為藥物連續(xù)灌胃 4w 組（F4w 組）</p&g

37、t;<p>　　和連續(xù)灌胃 8w 組（F8w 組）。每組 20 只。</p><p><b>　　模型建立</b></p><p>　　大鼠術前禁食 12～16 小時，禁水 2 小時。術前稱體重并注射少量阿托品，</p><p>　　抑制術中大鼠氣管內(nèi)分泌物增多。用 10%水合氯醛溶液（0.3ml/100g）腹腔注射，</p

38、><p>　　全麻麻醉。大鼠仰置手術臺板上，伸展并綁扎四肢，充分暴露胸部。剝離氣管行</p><p>　　氣管插管，連接小型動物呼吸機。與左胸第 4～5 肋間處切皮，逐層分離肌肉，</p><p>　　撕開壁層胸膜，剪斷一根肋骨，充分暴露左胸腔，移開左肺，顯露心臟，撕開心</p><p>　　包，在左心耳和肺動脈圓錐交界處向下 2～3mm 處，以

39、 6-0 線結扎左冠狀動脈前</p><p>　　降支，造成前壁心肌梗死。可見結扎部位以下及心尖部心肌顏色變蒼白，同時心</p><p>　　電圖顯示 ST 段弓背樣抬高，表示模型制作成功。然后逐層縫合關胸，待大鼠出</p><p>　　現(xiàn)自主呼吸之后，撤除呼吸機。假手術組僅在左冠狀動脈前降支處穿線，不接扎。</p><p>　　到實驗終點時

40、，大鼠以腹腔麻醉的方法處死，提取心肌組織放入冰浴的 1ml</p><p>　　Trizol 中保存在-80℃冰箱，待行 RT-PCR 和免疫組化。</p><p><b>　　心肌的免疫組化</b></p><p>　　每個標本取心臟橫切面石蠟連續(xù)切片 9 張分別做Ⅰ型膠原免疫組化觀察。</p><p>　　免疫組化染

41、色采用 SP 方法?？贵w稀釋度均為 1：100，DAB 顯色。一抗為兔抗</p><p>　　鼠膠原抗體。用 PBS 代替一抗作陰性對照。</p><p>　　免疫組織化學檢測具體步驟如下：</p><p>　?。?）切片常規(guī)脫蠟脫水：使用二甲苯脫蠟 2 次，每次 20min；乙醇梯度脫</p><p>　　水（分別為無水乙醇 2 次，每次

42、5min。95％乙醇 10min。85％乙醇 10min。75％</p><p>　　乙醇 10min。50％乙醇 10min。）</p><p><b>　　7</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　（2）30％H2O21 份＋蒸餾水 10 份混合，室溫避光 5～10 min

43、以滅活內(nèi)源</p><p>　　性酶，蒸餾水洗 3 次；</p><p>　?。?）熱修復抗原：將切片浸入 0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0），微波爐</p><p>　　或電爐加熱，沸騰后斷電，間隔 5～10min 后，反復 1～2 次。待冷卻后 PBS</p><p>　?。≒H7.2～7.6）洗滌 1～2 次。</p>

44、<p>　?。?）封閉：10％BSA（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 30min，甩去多余液體，</p><p><b>　　不洗。</b></p><p>　　（5）加入一抗（PBS 稀釋 1:400,25～30ul/片 ），37°環(huán)境下溫育 60min。PBS</p><p>　　洗 3 次，每次 3min。</

45、p><p>　　（6）加入二抗，37°環(huán)境下孵育 50min，PBS 洗 6 次，每次 3min。</p><p>　?。?）DAB 顯色：加入 DAB 顯色液，由顯微鏡下控制顯色時間，待組織著</p><p>　　色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液，自來水沖洗。</p><p>　?。?）蘇木素復染：45s，用自來水沖洗，鏡下觀察染色情

46、況。</p><p>　?。?）梯度酒精脫水（分別是 50％乙醇 7min。75％乙醇 7min。85％乙醇 7min。</p><p>　　95％乙醇 7min。無水乙醇 7min。），二甲苯浸泡 35min，中性樹膠封片。</p><p>　　（10）結果分析：顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性。采用</p><p>　　Biomi

47、as2001 彩色高清晰圖像分析系統(tǒng)進行分析，每張切片隨機取 5 個視野</p><p>　?。?#215;400），計數(shù) 100 個細胞中的陽性百分率。</p><p>　　心肌總 RNA 的提取和用 PCR 對 TGF-β 進行的檢測</p><p><b>　?。?）引物設計：</b></p><p>　　上游引物

48、 5′ GCTCCTGTGACAGCAGGGAT3′</p><p>　　下游引物 5′ GGCAGAAGTTGGCATGGTAG3′</p><p>　　（2）取 100mg 大鼠心肌組織剪碎，800ulTRIzol 勻漿，勻漿后將樣品轉(zhuǎn)入</p><p>　　EP 管中，按 20:1 的比例加入氯仿，蓋嚴，放置在漩渦混合器上持續(xù)振蕩 15s，</p>

49、<p>　　室溫下靜置 10min。</p><p>　?。?）于 4℃12000rpm 離心 15min，溶解在上層水相中的即為 RNA。</p><p>　?。?）將溶解在上層水相中的 RNA 轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入異丙醇用來沉淀 RNA，比例為 0.5:1，室溫下靜置 10min。</p><p>　?。?）于 4℃12000rpm 離心 1

50、0min，RNA 即沉淀于管底底壁。</p><p><b>　　8</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　?。?）丟棄上層液，加入 1ml75％的乙醇溶液用來洗滌 RNA 沉淀，7500rpm，</p><p>　　4℃的條件下離心 5min，丟棄上層液。（重復上一步驟）<

51、/p><p>　　（7）吸干試管內(nèi)的乙醇，在室溫下自然干燥 RNA 沉淀 5～10min，用 DECP</p><p><b>　　水溶解 RNA。</b></p><p>　　（8） 紫外吸收測定法測總 RNA 的濃度 取 1ulRNA 溶液用 99ulDECP 水</p><p>　　稀釋，用紫外分光光度儀檢測 RNA

52、濃度以及純度（OD260 值及 OD260/OD280</p><p>　　值）, OD260/OD280 比值在 1.8～2.0 之間。</p><p>　?。?） 應用 RT-PCR 方法（RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司</p><p>　　Takara Code :DRR081S）檢測 mRNA 的水平。</p><p>

53、;<b>　　3 統(tǒng)計學分析</b></p><p>　?、裥湍z原蛋白和 TGF-β 為計量資料，經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，用均數(shù)加減</p><p>　　標準差（ s ）表示，不同組間的差異比較采用成組設計的方差分析，有統(tǒng)計</p><p>　　學意義時進一步做兩兩比較；4w 和 8w 數(shù)據(jù)比較采用配對設計的 t 檢驗。使用</p>

54、;<p>　　SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05 認為有顯著性統(tǒng)計學意義。</p><p><b>　　。</b></p><p><b>　　9</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　結 果</b

55、></p><p>　　銀杏葉提取物、阿司匹林、卡托普利對大鼠 AMI后心肌Ⅰ型膠原蛋白的影響</p><p>　　銀杏葉提取物、阿司匹林、卡托普利對大鼠 AMI后心?、裥湍z原蛋白的影響</p><p>　　見表 1、圖 1-12。</p><p>　　表 1 A、B、C、D、E、F組大鼠心?、裥湍z原蛋白的變化（ s ）</p

56、><p>　　Tab 1 Change of protein of type I collagen in myocardium of in rats in groupA,B,C,D,E and F</p><p>　　Group n 4w 8w</p><p>　　A 6 5.61±2.07 5.34±1.55 B 6 42.57±10

57、.29* 44.01±7.32* C 6 23.83±5.38*# 12.66±4.31*#??D 6 24.48±9.51*# 13.73±5.15*#? E 6 21.79±7.91*# 11.41±3.87*#? F 6 25.22±7.48*# 14.52±3.06*#??</p><p>　　注：*與 A

58、組比較，P<0.01；#與 B 組比較，P<0.01；?與本組內(nèi) 4w 時比較，P<0.05；??與本組內(nèi) 4w 時比較，P<0.01。</p><p>　　圖 1ColⅠingroup A in 4w 圖 2 ColⅠin group B in 4w</p><p>　　4 周Ⅰ型膠原蛋白假手術組 4 周Ⅰ型膠原蛋白模型組</p><p>

59、;<b>　　10</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　圖 3 Col Ⅰ in group C in 4w 圖 4 Col Ⅰ in group D in 4w</p><p>　　4 周Ⅰ型膠原蛋白阿司匹林組 4 周Ⅰ型膠原蛋白卡托普利組</p><p>　　圖 5 Col

60、Ⅰin group E in 4w 圖 6 ColⅠingroup F in 4w</p><p>　　4 周Ⅰ型膠原蛋白銀杏葉高劑量組 4 周Ⅰ型膠原蛋白銀杏葉低劑量組</p><p>　　圖 7 ColⅠingroup A in 8w 圖 8 ColⅠin group B in 8w</p><p>　　8 周Ⅰ型膠原蛋白假手術組 8 周Ⅰ型膠原蛋白模型組<

61、;/p><p><b>　　11</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　圖 9 Col Ⅰ in group C in 8w 圖 10 Col Ⅰ in group D in 8w</p><p>　　8 周Ⅰ型膠原蛋白阿司匹林組 8 周Ⅰ型膠原蛋白卡托普利組</p>

62、<p>　　圖 11 ColⅠin group E in 8w 圖 12 ColⅠingroup F in 8w</p><p>　　8 周Ⅰ型膠原蛋白銀杏葉高劑量組 8 周Ⅰ型膠原蛋白銀杏葉低劑量組</p><p>　　由表 1、圖 1-12可見，于 4周和 8周時，與 A組比較，B、C、D、E、F組大</p><p>　　鼠的Ⅰ型膠原蛋白含量均顯著增高

63、（P＜0.01）；與 B 組比較，C、D、E、F 組大</p><p>　　鼠心肌的Ⅰ型膠原蛋白含量均顯著降低（P＜0.01）；于 8 周時，C、D、E、F 組</p><p>　　的心?、裥湍z原蛋白表達均顯著低于 4周時（P＜0.05 or ＜0.01）。4周（8周）</p><p>　　時，C、D、E、F組Ⅰ型膠原蛋白間比較，無統(tǒng)計學差異。</p>

64、<p><b>　　12</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　銀杏葉提取物、阿司匹林、卡托普利對大鼠 AMI后心肌表達 TGF-β1的影響</p><p>　　銀杏葉提取物、阿司匹林、卡托普利對大鼠 AMI后心肌表達 TGF-β1的影響</p><p><b&

65、gt;　　見表 2。</b></p><p>　　表 2 A、B、C、D、E、F 組大鼠心肌 TGF-β mRNA 的變化（ s ）</p><p>　　Tab 2 Change of TGF-β mRNA in myocardium of in rats in group A,B,C,D,E and F</p><p>　　Group n 4w 8

66、w</p><p>　　A 6 11.95±0.98 11.43±0.93 B 6 25.88±1.49* 24.95±2.54* C 6 20.10±1.37*# 14.68±1.31*#?D 6 21.98±3.13*# 13.93±1.15*#? E 6 18.61±2.37*# 14.55±1.03

67、*#? F 6 19.43±2.09*# 15.01±2.57*#?</p><p>　　注：*與 A 組比較，P<0.01；#與 B 組比較，P<0.05；?與同組 4 周時比較，P<0.01。</p><p>　　圖 13 Melt Curve Graph for FAM-490</p><p>　　TGF-β PCR 熔

68、點曲線圖</p><p><b>　　13</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　圖 14 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490</p><p>　　TGF-β PCR 擴增曲線圖</p><p>　　由圖 13及圖 14可知，T

69、GF-β PCR成特異性擴增。由表 2可見，于 4周和 8</p><p>　　周時，與 A 組比較，B、C、D、E、F 組大鼠的 TGF-β mRNA 表達均顯著增高（P</p><p>　　＜0.01）；與 B組比較，C、D、E、F組大鼠心肌的 TGF-β mRNA表達均顯著降低</p><p>　　（P＜0.05）；于 8周時，C、D、E、F組的心肌的 TGF

70、-β mRNA表達均顯著低于 4</p><p>　　周時（P＜0.01）。4周（8周）時，C、D、E、F組 TGF-β mRNA間比較，無統(tǒng)計</p><p><b>　　學差異。</b></p><p><b>　　14</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p&g

71、t;<p><b>　　討 論</b></p><p>　　AMI發(fā)生之后，可引起左心室繼發(fā)性的出現(xiàn)擴張，從而引起心功能不全甚至導</p><p>　　致心功能衰竭。這種心室代償性擴張是一個長期過程，由射血分數(shù)的降低所引起,</p><p>　　這個過程稱之為左心室重塑（Left Ventricular Remodeling，LV

72、RM）。LVRM不僅</p><p>　　能夠引起心室擴張，使心肌增厚，而且能夠?qū)е翧MI患者的左室功能嚴重下降，并</p><p>　　發(fā)癥增多，死亡率升高。因此，限制或者逆轉(zhuǎn)LVRM已經(jīng)成為目前心血管領域中重</p><p>　　要的研究內(nèi)容之一[11]。</p><p>　　心室重塑是一系列復雜的分子和細胞機制引起的心肌細胞機構、功能及

73、表型</p><p>　　的改變，臨床上表現(xiàn)為心肌重塑和心室容量增加以及心室形狀的改變，橫徑增加</p><p>　　成球形[12-13]。心肌重塑的發(fā)展過程被認為是各種病因?qū)е峦砥谛牧λソ吖餐陌l(fā)</p><p>　　病機制[14-16]。</p><p>　　近年來研究表明，TGF-β分子通路在心血管系統(tǒng)的損傷和修復過程中起了重</

74、p><p>　　要的作用。TGF-β超家族包括 TGF-βS（即狹義的 TGF-β）、活化素、抑制素、</p><p>　　骨形成蛋白及苗勒抑制物等。TGF-βs包括了不同亞型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-</p><p>　　β3），其中 TGF-β1在體細胞系中所占比例最高，活性最強，功能最多，分布最</p><p>　　廣泛。TGF

75、-β1 能夠直接并且強有力的作用于肥大的心肌以及心肌細胞外基質(zhì)，</p><p>　　是心肌重塑過程中必不可少的一個重要調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 抑制劑可以</p><p>　　使左室重塑減弱，抑制心臟的肥大并且能夠減少心室非梗死區(qū)纖維化的發(fā)生[17]。</p><p>　　本研究顯示，銀杏葉提取物灌胃 4周后，與模型組比較，銀杏葉提取物組大</p>

76、;<p>　　鼠 TGF-β1mRNA表達顯著降低；灌胃 8周后，銀杏葉提取物組大鼠的 TGF-β1mRNA</p><p>　　表達顯著低于灌胃 4周時銀杏葉提取物組，提示銀杏葉提取物能夠降低 AMI大鼠</p><p>　　心肌中 TGF-β1的表達，并與作用時間成正比，而且影響在 TGF-β1表達的轉(zhuǎn)錄</p><p>　　水平。推測銀杏葉提取物

77、可能通過降低 TGF-β1的表達抑制 AMI后心肌重塑，此</p><p>　　對心功能衰竭的防治可能具有一定的作用。</p><p>　　AMI后 LVRM中膠原蛋白的地位也逐漸受到了越來越多的重視。目前研究</p><p><b>　　[18-20]</b></p><p>　　明確，心臟膠原蛋白包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、

78、Ⅵ五種類型。其中Ⅰ型膠原蛋白約占</p><p>　　心肌膠原蛋白總數(shù)的 51％左右[21]。Ⅰ型膠原蛋白主要聚合形成粗纖維，其彈性</p><p>　　和伸展性較小，僵硬度比較大，并且有很強的抗牽拉特性，心室壁張力的形成和</p><p>　　維持與其有關。Ⅰ型膠原蛋白在保護、支持心肌細胞，維持心臟的幾何構型，協(xié)</p><p><b

79、>　　15</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p>　　調(diào)力量傳導，存儲能量，影響心肌的僵硬度以及參與損傷心肌細胞的修復等方面</p><p>　　起著至關重要的作用。近年來，AMI后心肌重塑中心肌的膠原基質(zhì)所發(fā)揮的作用</p><p>　　越來越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死后損傷最為嚴

80、重的是細纖維，細纖維的</p><p>　　強度不夠，導致了心肌梗死范圍的擴大，此時Ⅰ型膠原蛋白受到刺激合成增加，</p><p>　　以此來維持心臟的完整性[22-24]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，丹參能干預大鼠的心肌重塑，</p><p>　　同時能夠降低心肌中Ⅰ型膠原含量[25]，另有研究顯示，黃芪中的總黃酮能夠改善</p><p>　　心肌梗死

81、后的血流動力學[26-28]，提示某些中藥能夠通過降低心肌中Ⅰ型膠原含量</p><p><b>　　抑制心肌重塑。</b></p><p>　　本研究顯示，銀杏葉提取物灌胃 4周后，與模型組比較，銀杏葉提取物組大</p><p>　　鼠Ⅰ型膠原蛋白表達顯著降低；灌胃 8周后，銀杏葉提取物組大鼠的Ⅰ型膠原蛋</p><p&g

82、t;　　白表達顯著低于灌胃 4 周時銀杏葉提取物組，表明銀杏葉提取物能夠降低 AMI</p><p>　　大鼠心肌中Ⅰ型膠原蛋白表達，并與作用時間成正比。提示銀杏葉提取物能夠通</p><p>　　過降低Ⅰ型膠原蛋白表達抑制 AMI后心肌重塑，此為 AMI后心功能衰竭的防治提</p><p><b>　　供了一個新視角。</b></p&g

83、t;<p>　　本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能夠顯著降低 AMI大鼠心肌 TGF-β1和Ⅰ型膠原</p><p>　　的表達，但其通過抑制心肌 TGF-β1而降低Ⅰ型膠原的表達抑或是通過抑制Ⅰ型</p><p>　　膠原而降低 TGF-β1的表達尚不清楚。有研究表明，心肌梗死后，TGF-β與Ⅰ型</p><p>　　膠原的表達呈正相關。心肌梗死后 TGF-

84、β顯著增加，并作用于膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄</p><p>　　和翻譯過程，誘導產(chǎn)生前膠原 mRNA，從而進一步促進了膠原蛋白的形成和沉積</p><p>　　[29-30]，促進心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原的合成。由此推測，銀杏葉提取物可能通過</p><p>　　降低 AMI大鼠心肌 TGF-β1通路進一步抑制了Ⅰ型膠原蛋白的表達。但具體機制</p><p

85、><b>　　尚待進一步研究。</b></p><p><b>　　16</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學院碩士論文</p><p><b>　　結 論</b></p><p>　　1、銀杏葉提取物能夠降低AMI大鼠心肌中TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白的表達，

86、</p><p>　　并與作用時間成正比。</p><p>　　2、銀杏葉提取物對AMI大鼠心肌中TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白的作用不弱于阿司</p><p><b>　　匹林和卡托普利。</b></p><p><b>　　17</b></p><p>　　2013 屆貴陽醫(yī)學

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