基于免疫彩色二氧化硅微球新型凝集技術(shù)研究.pdf

1、對(duì)致病微生物及其毒素等有害物質(zhì)更好的快速檢測(cè)方法和技術(shù)是保障對(duì)其污染食品和感染實(shí)施有效監(jiān)測(cè)、監(jiān)管、質(zhì)控、預(yù)防和及時(shí)診斷的必要條件，也是相關(guān)檢驗(yàn)檢疫部門的需求和有關(guān)研究人員研究的熱點(diǎn)。在多種快速檢測(cè)技術(shù)中，凝集試驗(yàn)(Agglutination test)因其具有操作簡(jiǎn)便易行、不需特殊貴重儀器和結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全、獸醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域被各級(jí)檢驗(yàn)檢疫部門廣泛使用，其中間接凝集試驗(yàn)(Indirect agglutination tes

2、t)因?yàn)橛休d體加入而較直接凝集實(shí)驗(yàn)更加敏感和易于判別檢測(cè)結(jié)果。間接凝集實(shí)驗(yàn)所用載體對(duì)其性能有重要影響，常規(guī)用載體有綿羊紅細(xì)胞和聚苯乙烯乳膠微球兩種，前者與抗體結(jié)合能力較好，且具有較鮮艷紅色，利于檢測(cè)結(jié)果判斷，但其穩(wěn)定性較差，處理并標(biāo)記好的紅細(xì)胞也不夠穩(wěn)定，易發(fā)生溶血，也易被污染，難長(zhǎng)時(shí)間保存;聚苯乙烯乳膠微球經(jīng)濟(jì)、易得，比紅細(xì)胞穩(wěn)定，但也較易溶脹破裂，且與蛋白的結(jié)合能力及凝集性能都較差，本身無(wú)色，用其作載體的凝集結(jié)果也不利觀察;再有，用

3、這兩種載體檢測(cè)都只能同時(shí)檢測(cè)一種抗原。因此，尋找更加理想的載體是改進(jìn)間接凝集實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。
　　隨著納米技術(shù)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，將納米顆粒與生物測(cè)定方法相結(jié)合用于致病菌檢測(cè)越來(lái)越受到人們的關(guān)住，使用納米材料修飾和標(biāo)記生物抗體，制備免疫納米微球，已被廣泛應(yīng)用到致病菌的檢測(cè)當(dāng)中。本論文使用反相微乳體系制備彩色二氧化硅微球(ColoredSilica Nanoparticles，CSN)，再通過(guò)化學(xué)交聯(lián)法將抗體修飾到彩色二氧化硅微球

4、表面制備得到免疫彩色二氧化硅微球（Immune ColoredSilica Nanoparticles，ICSN），并基于ICSN構(gòu)建新型凝集技術(shù)用于致病菌的快速檢測(cè)。通過(guò)該新型凝集技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)一種或兩種及更多種食源性致病菌的快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)。本論文主要從以下幾個(gè)方面展開了研究:
　　1單分散免疫彩色二氧化硅微球(ICSN)的制各研究
　　以反相微乳液法為基礎(chǔ)，采用正己烷作溶劑，正硅酸乙酯(TEOS)在氨水催化

5、下發(fā)生水解縮聚反應(yīng)，在硅烷偶聯(lián)劑存在的條件下，生成的二氧化硅微球被修飾上有機(jī)活性染料得到彩色二氧化硅微球(Colored silica nanoparticles，CSN)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了反應(yīng)條件對(duì)成球粒徑及單分散的影響，用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡SU-70和Nano2S激光粒度電位儀對(duì)樣品的形貌和粒度進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，隨正硅酸乙酯和氨水量的增大，生成的二氧化硅微球的粒徑逐漸增大;水的量和溫度的變化對(duì)微球的粒徑和

6、分散度影響較大。另一方面，向反應(yīng)體系中加入硅烷偶聯(lián)劑KH-550可以有效減小微球之間的團(tuán)聚，并增大了有機(jī)活性染料對(duì)微球的染色效果，從而為制備單分散彩色二氧化硅微球提供了有效的方法。論文中還討論了相關(guān)的反應(yīng)機(jī)理，根據(jù)這些反應(yīng)條件的變化可以確定制備不同粒徑的單分散彩色二氧化硅微球所需的最優(yōu)條件。在最優(yōu)反應(yīng)條件下制備得到CSN，將合成好的CSN與致病菌抗體孵育結(jié)合，制成ICSN，以用于食源性致病菌的快速檢測(cè)。
　　2快速檢測(cè)雞白痢雞傷寒

7、沙門氏菌新型凝集技術(shù)研究
　　為探求雞白痢雞傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)的新型凝集技術(shù)，本研究嘗試用三種有機(jī)活性染料與抗體分別修飾二氧化硅活性微球制成ICSN，構(gòu)建快速檢測(cè)雞白痢雞傷寒沙門菌新型凝集技術(shù)。利用第一部分所討論的反相微乳法首先制備CSN，用掃描電鏡表征其形貌特征和分散程度，通過(guò)凝集現(xiàn)象表征ICSN對(duì)雞白痢雞傷寒沙門氏菌的檢測(cè)效果。結(jié)果表明該新型凝集技術(shù):靈敏度好，其凝集結(jié)果醒目、直觀、易于肉眼判別，且耗用抗體不到常規(guī)凝集試驗(yàn)的

8、1/500，對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)范圍為102～109 cfu·mL-1;重復(fù)性和穩(wěn)定性好，4℃放置28d后，凝集效果與放置前無(wú)顯著差異;具有較好的特異性和準(zhǔn)確性。因此，用ICSN構(gòu)建的新型凝集技術(shù)具有靈敏、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于雞白痢雞傷寒沙門氏菌的快速檢測(cè)。
　　3快速檢測(cè)阪崎腸桿菌新型凝集技術(shù)研究
　　為探求快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的新型技術(shù)，本研究嘗試用有機(jī)活性染料與阪崎腸桿菌抗體共修飾二氧化硅活性微球制成對(duì)阪

9、崎腸桿菌有特異性的免疫彩色二氧化硅微球(Immune Colored SilicaNanoparticles，ICSN)，構(gòu)建快速檢測(cè)阪崎腸桿菌新型凝集技術(shù)。首先利用反相微乳法制備彩色二氧化硅微球(Colored SilicaNanoparticles，CSN)，用掃描電鏡表征其形貌特征和分散程度，通過(guò)凝集現(xiàn)象評(píng)估對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)效果。結(jié)果表明該新型凝集技術(shù):靈敏度高，對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)范圍為102～109 cfu·mL-1，其凝集結(jié)果醒

10、目、直觀、易于肉眼直觀判別;重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且具有好的特異性和準(zhǔn)確性。22～37℃的條件下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象較快，僅為20～30 s。用ICSN構(gòu)建的新型凝集技術(shù)具有靈敏、快速、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于快速檢測(cè)阪崎腸桿菌，還可為其它食源性致病微生物快速檢測(cè)提供研究基礎(chǔ)模型，具有較好的應(yīng)用前景。
　　4基于ICSN同時(shí)快速檢測(cè)多種致病菌新型凝集技術(shù)的研究
　　本章嘗試用制備好的紅色和橙黃色的單分散彩色二氧化硅微球(

11、Colored Silica Nanoparticles，CSN)作為載體，制備兩種免疫彩色二氧化硅活性微球（Immune Colored Silica Nanoparticles，ICSN）。先對(duì)這兩種CSN進(jìn)行羧基活化后再分別修飾雞白痢抗體和阪崎腸桿菌抗體，最后將其進(jìn)行混合制成對(duì)兩種致病菌都有特異性的ICSN混合溶液。對(duì)雞白痢雞傷寒沙門氏菌和阪崎腸桿菌的混合懸菌液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該新型凝集技術(shù)檢測(cè)速度快，僅20～30 s即可出現(xiàn)