[優(yōu)秀畢業(yè)設(shè)計精品] 醬油中乙酰丙酸測定方法研究

1、<p>　　醬油中乙酰丙酸測定方法研究</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　由于生產(chǎn)工藝的不同，醬油可分為釀造醬油、水解醬油和配制醬油三種。這三種醬油的生產(chǎn)成本及營養(yǎng)價值差異很大，其中釀造醬油營養(yǎng)價值及生產(chǎn)成本最高，為有效防止其他種類的醬油冒充釀造醬油，保護消費者的利益，急需建立有效的可操作性的分析方法。釀造醬油中乙酰丙酸含

2、量極微，而其他醬油中乙酰丙酸含量相對較高，所以醬油中乙酰丙酸的含量是區(qū)分釀造醬油和其他醬油的重要指標之一。本文采用高效液相色譜法研究了醬油中乙酰丙酸含量的測定方法，結(jié)果表明：當色譜條件為Lichrspher-C18（150mm×4.6mm, i.d.5μm）,流動相甲醇：水=15:85，流速1.0mL/min,檢測波長266nm，進樣體積5μL，采用了標準加入法定量，乙酰丙酸加入量與其峰面積在5.00～25.00mg·

3、;mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，方法的重現(xiàn)性（RSD）為2.3%。經(jīng)用于實際樣品分析，在釀造醬油中，其相關(guān)系數(shù)r為0.9995 ，平均加標回收率為99.1% ；在配制醬油中，其相關(guān)系數(shù)r為0.9996 ，平均加標回收率為98.5%。此法操作簡單、快速，符合要求。</p><p>　　關(guān)鍵詞：乙酰丙酸，高效液相色譜法，醬油 </p><p>　　Study on the analysis

4、method of Levulinic Acid in soy sauce </p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Soy sauce is consist of the blended soy sauces, the hydrolytic soy sauce and fermented soy sauce because of d

5、ifferent technique of production. These three soy sauces differ greatly in production cost and nutritive value, and the fermented soy sauce has the highest production cost and nutritive value. In order to avoid other soy

6、 sauces personating the fermented soy sauce, there is an urgent need to establish effective and practicable method to protect the benefit of consumers. The content of levu</p><p>　　Keywords：Levulinic acid; H

7、PLC; Soy sauce;</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒 論1</b></p><p><b>　　1.1 引言1</b></p><p>　　1.2乙酰丙酸的性質(zhì)1</p><p>　　1.3

8、乙酰丙酸的提取分離方法1</p><p>　　1.3.1有機溶劑萃取法2</p><p>　　1.3.2 蛋白質(zhì)沉淀法2</p><p>　　1.3.3 真空減壓蒸餾法2</p><p>　　1.3.4 離子交換法2</p><p>　　1.4乙酰丙酸的檢測方法3</p><p>　

9、　1.4.1 香草醛-硫酸法3</p><p>　　1.4.2 氣相色譜法3</p><p>　　1.4.3 薄層掃描法3</p><p>　　1.4.4 離子色譜法3</p><p>　　1.4.5 高效液相色譜法3</p><p>　　1.5乙酰丙酸的高效液相色譜法4</p><p&

10、gt;　　2 實驗材料及原理5</p><p><b>　　2.1實驗材料5</b></p><p>　　2.1.1實驗藥品5</p><p>　　2.1.2實驗儀器5</p><p>　　2.2溶液的配制5</p><p><b>　　2.3實驗原理6</b>&

11、lt;/p><p><b>　　2.4實驗方法6</b></p><p>　　2.4.1樣品前處理方法6</p><p>　　2.4.2樣品溶液的制備6</p><p>　　2.4.3樣品測定6</p><p>　　2.4.4定性測定6</p><p>　　2.4.5

12、定量測定7</p><p>　　3 實驗結(jié)果及討論8</p><p>　　3.1 高效液相色譜法測定條件的選擇8</p><p>　　3.1.1液相色譜法檢測器種類的選擇8</p><p>　　3.1.2實驗測定波長的選擇8</p><p>　　3.1.3色譜柱的選擇9</p><p&g

13、t;　　3.1.4流動相體系的選擇9</p><p>　　3.1.5流動相配比的選擇10</p><p>　　3.1.6 流動相流速的選擇12</p><p>　　3.1.7柱溫的選擇13</p><p>　　3.1.8色譜分離條件的最終確定14</p><p>　　3.2標準曲線及線性范圍的測定15<

14、;/p><p>　　3.3精密度的測定15</p><p>　　3.4穩(wěn)定性試驗16</p><p>　　3.5重復(fù)性試驗16</p><p>　　3.6樣品含量及回收率試驗17</p><p>　　3.6.1釀造醬油樣品含量及回收率試驗17</p><p>　　3.6.2配制醬油樣品含量

15、及回收率試驗18</p><p>　　3.7新穎之處19</p><p><b>　　4 結(jié) 論21</b></p><p><b>　　參考文獻22</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　附 表24&

16、lt;/b></p><p><b>　　1 緒 論</b></p><p><b>　　1.1 引言</b></p><p>　　乙酰丙酸是一種重要的化工原料，在醫(yī)藥、吸附劑、涂料、食品調(diào)味料等方面有廣泛的用途[1-2]。醬油中的乙酰丙酸是由于植物原料中淀粉在酸的條件下經(jīng)酸解成葡萄糖，葡萄糖轉(zhuǎn)化成羥甲基糠醛，再分解

17、成乙酰丙酸，一般而言，純釀造醬油中乙酰丙酸的含量極微[3]，而配制醬油是以釀造醬油為主體，與酸水解植物蛋白調(diào)味液、食品添加劑等配制而成的液體調(diào)味液[4]，這種醬油中乙酰丙酸的含量要比釀制醬油中的高出許多，而在醬油中乙酰丙酸不得超過一定含量，故醬油中乙酰丙酸含量成為判斷是否為釀造醬油的可靠指標。因此，醬油中乙酰丙酸含量的測定具有非常重要的意義。</p><p>　　1.2乙酰丙酸的性質(zhì)</p><

18、;p>　　乙酰丙酸(Levulinic Acid, LA),又名戊隔酮酸、果糖酸、左旋糖酸,呈白色片狀結(jié)晶,易燃，有吸濕性，熔點37.2℃,沸點245~246℃,折射率1.4396(20℃),極易溶于水、醇、醚，其水溶液的酸性比醋酸強。常壓下蒸餾幾乎不分解，若長時間加熱則會失水而成為不飽和的γ-內(nèi)酯。</p><p>　　乙酰丙酸的分子式為:C5H8O3,結(jié)構(gòu)式為: </p><p>

19、;　　由于分子中同時含羰基、氫和羧基 ,所以同時具備羧酸和酮的性質(zhì),能夠進行酯化、加氫、鹵化、聚合等多種反應(yīng)。它的4位碳原子是一個不對稱碳原子,因此可以進行手性合成和拆分。利用這些性質(zhì),乙酰丙酸可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、生物活性材料、化妝品、滑潤劑、香料、填料、防凍劑、防腐劑、表面活性劑、涂料和電子產(chǎn)品等眾多領(lǐng)域。乙酰丙酸具備了這些優(yōu)良的性質(zhì)使其成為了一種新型平臺化合物 [5]。</p><p>　　1.3乙酰丙酸的提取

20、分離方法</p><p>　　由于醬油中成分復(fù)雜，如果將樣品直接稀釋進行測定時，會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，所以在分析前要將醬油中的其他干擾組分盡量去除或掩蔽，以得到準確的結(jié)果，其實，早在十九世紀四十年代，人們就已經(jīng)認識了乙酰丙酸，對乙酰丙酸的分離提純也有一些方法</p><p>　　1.3.1有機溶劑萃取法 </p><p>　　有機溶劑萃取是選用合適的有機溶劑，首先

21、利用相似相容的原理將乙酰丙酸從混合液中分離出來，然后利用萃取劑與乙酰丙酸的沸點不同，再蒸餾回收萃取劑，從而得到比較純的乙酰丙酸，仲辛醇和乙醚是常用的萃取溶劑。有機溶劑萃取法適于醬油中乙酰丙酸的提取。該法成本不高, 但是醬油中乙酰丙酸的含量很低，在提取的過程中會有損耗，但是由于效果不錯，避免了其他物質(zhì)的干擾，現(xiàn)在還是有很多人使用該法。賀才珍等[6]研究了高效液相色譜法測定醬油中乙酰丙酸的含量，在確定實驗方法時，確定了萃取條件為：提取次數(shù)4

22、次，提取時所需無水乙醚的量120mL。</p><p>　　1.3.2 蛋白質(zhì)沉淀法</p><p>　　蛋白質(zhì)沉淀法是根據(jù)醬油中的蛋白質(zhì)因某些有機溶劑的加入而使其從溶液中沉淀而出[7]。其儀器設(shè)備簡單、操作簡單、能耗低，但是只能除去部分干擾物質(zhì)。江勇等[8]用22%的乙酸鋅和10.6%的亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，將樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，除去了部分干擾，得到了滿意的結(jié)果。</p>

23、<p>　　1.3.3 真空減壓蒸餾法</p><p>　　目前常用的提取乙酰丙酸的方法是真空減壓蒸餾法。乙酰丙酸經(jīng)纖維素水解得到后，再加入石灰乳中和，在除去硫酸鈣后，過濾，然后經(jīng)兩次真空精餾，可以得到純度較高的乙酰丙酸成品，但是這種方法的缺點就是生成硫酸鈣副產(chǎn)品，而且真空蒸餾能耗大[9]。</p><p>　　1.3.4 離子交換法</p><p>

24、　　從水解液中分離乙酰丙酸可以采用離子交換法 [10]。該方法是將含有雜質(zhì)的乙酰丙酸水解液通過弱堿陰離子交換樹脂柱。不吸附的雜質(zhì)先用去離子水洗去，而吸附在樹脂上的乙酰丙酸和甲酸用酸水溶液洗脫。高含量的乙酰丙酸是乙酰丙酸洗脫液經(jīng)過常壓濃縮和減壓精餾得到的。王永利等[11]采用了離子交換法分離提取乙酰丙酸，與傳統(tǒng)分離方法相比，此方法清潔無污染并節(jié)省能源，是一種新型可用的分離技術(shù)[12].</p><p>　　乙酰丙酸

25、的分離提取方法很多，但是考慮到實驗室的條件和具體操作條件，可以實施的有機溶劑萃取法和蛋白質(zhì)沉淀法，因釀造醬油中乙酰丙酸的含量極微，如果采取萃取法，在過程中或多或少會有損耗，對結(jié)果的測定會有影響，再加上乙醚會致使人昏迷，在使用的過程中對人的身體會有傷害，因此本文選擇了江勇等已經(jīng)使用的樣品前處理方法：蛋白質(zhì)沉淀法。</p><p>　　1.4乙酰丙酸的檢測方法</p><p>　　1.4.1

26、香草醛-硫酸法</p><p>　　乙酰丙酸在硫酸介質(zhì)中，并且在重鉻酸鉀充分氧化條件下，在一定的溫度下與香草醛反應(yīng)，因乙酰丙酸的濃度不同，而呈現(xiàn)不同的顏色，顏色的深淺與乙酰丙酸的含量有關(guān)。該法能準確定性，而且可在一定程度上估計出醬油中乙酰丙酸的含量，但是操作麻煩、標準色階只在短時間內(nèi)穩(wěn)定。賀才珍等[13]用香草醛-硫酸對醬油中乙酰丙酸的含量進行了半定量的分析，其反應(yīng)溫度和香草醛的濃度都對結(jié)果有很大的影響。蘇萍等[

27、14]也采用了香草醛顯色法，結(jié)果表明顯色劑用量為2mL，溫度為80℃，加熱時間為15min的條件下，顯色效果好。</p><p>　　1.4.2 氣相色譜法</p><p>　　氣相色譜法是現(xiàn)代儀器分析的重要研究領(lǐng)域之一，具有獨特、高效、快速的分離特性[15]。目前，有關(guān)乙酰丙酸的色譜測定方法有直接法和間接法兩類，間接法是先將乙酰丙酸酯化，然后用氣相色譜分析[16-18]，但是這種法操作繁

28、瑣，而且在預(yù)處理過程中易產(chǎn)生誤差，從而影響結(jié)果的準確性；而直接法[19-20]具有結(jié)果準確、簡單快速的特點。蔡磊等[21]用氣相色譜法直接分析生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的乙酰丙酸，選擇了合適的內(nèi)標物和操作條件，取得了滿意的結(jié)果。而目前行業(yè)標準中，醬油中乙酰丙酸的測定也是采用的氣相色譜法[22]，樣品經(jīng)酸化后，用有機溶劑乙醚提取乙酰丙酸，內(nèi)標物質(zhì)為正庚酸，并選擇氫火焰離子化檢測器，以內(nèi)標法或外標法（標準曲線法）進行定量。</p>&l

29、t;p>　　1.4.3 薄層掃描法</p><p>　　薄層掃描法又稱薄層層析法，是在柱色譜和紙色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種色譜分析方法，是一種新型儀器分析方法，可同時對各種復(fù)雜的樣品進行分離和測定，其方法簡便快速、靈敏度高、專屬性好[23]。Chen C M等[24]在Study on Discrimination Between Fermented Soy Sauce and Synthetic Soy

30、Sauce 中采用了薄層掃描法，但是只能定性和半定量，不能準確測定其含量。</p><p>　　1.4.4 離子色譜法</p><p>　　1975年H. Small提出把電導(dǎo)檢測器用于離子交換色譜，在分析柱和檢測器之間增加了一個抑制柱，消除了洗脫液中離子對檢測器的干擾，本方法具有靈敏度高、儀器價格低的特點。任飛等[25]采用離子色譜法測定了醬油中的乙酰丙酸，選擇的色譜條件為：AS18HC

31、離子色譜分析柱。KOH等梯度淋洗，抑制性電導(dǎo)檢測，并采用外標法定量，得到了很好的效果。</p><p>　　1.4.5 高效液相色譜法</p><p>　　高效液相色譜法是在引入氣相色譜理論后，并在原有的液相柱層析基礎(chǔ)上加以改進和發(fā)展起來的[26]。它是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同比例的混合溶劑或不同極性的單一溶劑等流動相泵入裝有固定相的色譜柱中，在當柱內(nèi)各成分被分離后，進

32、入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分離與分析。</p><p>　　其原理是液體流動相攜帶著樣品流經(jīng)色譜柱，由于樣品在固定相之間的溶解、吸附等作用的不同，樣品在兩相間進行連續(xù)多次地分配過程，使得分配系數(shù)K不同的各組分，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，由于在固定中的移動速度不同，彼此分離開來，先后流出色譜柱。</p><p>　　該方法不僅具有高壓、高速、高效、檢測靈敏度高等特點，且適應(yīng)于高沸點的、

33、不能氣化的、熱穩(wěn)定性差的以及具有生理活性物質(zhì)的分析[27]。江勇等提出了用C18柱測定醬油中的乙酰丙酸，配制要求簡單，精密度好，靈敏度高，檢測時間短，適合在實際中應(yīng)用。SHN-LNG等[28]用柱后衍生法，并采用陽離子交換樹脂色譜柱，檢測了醬油中的乙酰丙酸，設(shè)備要求高，色譜柱昂貴，且運行時間長，不適合快速檢測，應(yīng)用不廣泛。段文仲等[29]采用了高效液相色譜法來測定醬油中的乙酰丙酸，設(shè)備簡單，但是由于沒有對樣品進行處理，使得結(jié)果不是很準確

34、。SANO A等[30]檢測配制醬油中的乙酰丙酸含量則是采用液相色譜-質(zhì)譜法，并以乙酰丙酸的含量推算醬油中植物蛋白水解物的添加量，該法的檢測限為0.0lmg/mL，利用該法在純釀造醬油中沒有檢測到乙酰丙酸。</p><p>　　乙酰丙酸的檢測方法同樣有很多，但是由于實驗室的條件有限，沒有薄層掃描色譜儀和離子色譜儀，香草醛-硫酸法只能準確定性，不能準確定量，而氣相色譜法雖既可定性又可定量，但是前處理復(fù)雜，需要用乙醚

35、萃取，耗時長，成本高，因此選擇了高效液相色譜法。</p><p>　　1.5乙酰丙酸的高效液相色譜法</p><p>　　綜上所述，本文擬采用實驗方法為：在進樣前，用22%的乙酸鋅和10.6%的亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，過濾后，出去部分干擾物；而檢測方法則選用高效液相色譜法，使用標準品尋找最佳的液相色譜條件，在這樣的色譜條件下，繪出乙酰丙酸的標準曲線，并進行乙酰丙酸標準品的精密度和穩(wěn)定性試驗，

36、而后測定經(jīng)前處理后的醬油樣品，得出樣品的濃度并測出加標回收率。</p><p><b>　　2 實驗材料及原理</b></p><p><b>　　2.1實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1實驗藥品</b></p><p>　　表 2.1.1 藥品表<

37、/p><p><b>　　2.1.2實驗儀器</b></p><p><b>　　表2.1.2儀器表</b></p><p><b>　　2.2溶液的配制</b></p><p>　　2.2.1.對照品溶液的制備（乙酰丙酸儲備溶液）(50.0mg·mL-1)：稱取1.25

38、00g乙酰丙酸于25mL的容量瓶中，用超純水定容至刻度。</p><p>　　2.2.2.22%乙酸鋅溶液：稱取22g乙酸鋅于100mL燒杯中，用超純水溶解，待其完全溶解后，移入100mL容量瓶中，定容至刻度。</p><p>　　2.2.3.10.6%亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀于100mL燒杯中，用超純水溶解，待其完全溶解后，移入100mL容量瓶中，定容至刻度。</p

39、><p><b>　　2.3實驗原理</b></p><p>　　乙酰丙酸屬于低級有機酸，由其結(jié)構(gòu)式可知由于羰基的作用，與相同碳數(shù)有機酸相比有更強的極性。</p><p>　　色譜法的分離原理是流動相帶著樣品流經(jīng)固定相，由于樣品中乙酰丙酸與其他物質(zhì)在C18固定相之間的溶解、吸附作用的不同，樣品在兩相間進行連續(xù)多次地分配過程，使得分配系數(shù)K不同的各組

40、分，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，由于在固定中的移動速度不同，彼此分離開來，先后流出色譜柱。</p><p>　　而色譜分析的目的是對樣品的組成或含量進行分析。其定性的方法有保留時間和保留體積定性、加入已知物增加峰高定性、利用文獻的保留值數(shù)據(jù)定性等；目前常用的定量方法主要有歸一化法、內(nèi)標法和外標法三種。</p><p><b>　　2.4實驗方法</b></p>

41、<p>　　2.4.1樣品前處理方法</p><p>　　醬油中成分復(fù)雜，包含多種氨基酸和大量有機酸，如果直接稀釋進樣，會有其他雜峰干擾。因此選擇用乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑，來將樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，過濾后，可除去部分干擾物。</p><p>　　2.4.2樣品溶液的制備</p><p>　　取5.0mL的樣品溶液于25mL的容量瓶中，分

42、別加2.0mL的22%乙酸鋅溶液和10.6%亞鐵氰化鉀溶液，用超純水定容至刻度，混合均勻后，離心，過濾，取經(jīng)0.45μm濾膜過濾后的濾液進樣分析。</p><p><b>　　2.4.3樣品測定</b></p><p>　　取醬油樣品溶液按3.1.8設(shè)定的高效液相色譜分析條件，待儀器穩(wěn)定后，采用六通閥進樣器直接進樣測定，進樣量為5μL。</p><

43、p><b>　　2.4.4定性測定</b></p><p>　　醬油樣品溶液按3.1.8設(shè)定的高效液相色譜條件進行測定。進行樣品測定前，可以在同一測定條件下，一方面可以根據(jù)物質(zhì)的保留時間定性，看檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液的保留時間是否一致，以此來判定樣品中是否存在乙酰丙酸；另一方面可以利用加入已知物增加峰高定性來判斷醬油中是否存在乙酰丙酸及判斷乙酰丙酸出峰位置。</p>

44、;<p><b>　　2.4.5定量測定</b></p><p>　　在液相色譜條件下，色譜柱：Lichrspher-Cl8(4.6 mm ×150 mm，5μm )；流動相：甲醇-水=15:85；流速：0.6ml·min-1；柱溫：25℃ ；檢測器：DAD檢測器，波長：266nm；進樣量：5μL。</p><p>　　本方法中采用標

45、準加入法，又名標準增量法進行了定量測定。其方法是在6份相同量得待測樣品中加入乙酰丙酸對照品溶液（2.2.1），其中加入的體積分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后按照3.1.8設(shè)定的實驗條件，分別取5μL的混合樣，注入色譜儀，得到色譜圖，測出峰面積(或峰高)，作出峰面積(或峰高)對加入標準含量的標準曲線，用外推法(延長標準曲線和橫坐標相交的數(shù)的絕對值)就可得到樣品液濃度。</p><p>

46、<b>　　3 實驗結(jié)果及討論</b></p><p>　　3.1 高效液相色譜法測定條件的選擇</p><p>　　高效液相色譜分析的關(guān)鍵問題是分離和檢測。混合物能否分離主要決定于色譜柱，分離后的組分能否靈敏準確檢測出來則取決于檢測器，因此，選擇正確的色譜柱和檢測器是非常重要的。</p><p>　　3.1.1液相色譜法檢測器種類的選擇<

47、;/p><p>　　高效液相色譜檢測器是高效液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一，能正確地檢測經(jīng)色譜柱后流出物中待測組分的含量或濃度。其種類有紫外及紫外可見檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器等，其中示差折光檢測器和電化學(xué)檢測器屬于整體檢測器，此類檢測器測定靈敏度低，易受溫度和流量波動的影響，造成較大的漂移和噪聲，不適合痕量分析；而紫外吸收檢測器是測量溶質(zhì)對紫外光的吸收，靈敏度高，且對流動相流量和溫度變化不敏感，又由

48、于乙酰丙酸分子的結(jié)構(gòu)式：</p><p>　　因為其含有雙鍵，理論上在紫外有吸收，所以，在實驗整個過程中選擇使用紫外檢測器。</p><p>　　3.1.2實驗測定波長的選擇</p><p>　　配制一定量的乙酰丙酸的水溶液，取一定的量乙酰丙酸標準品于25mL的比色管中，加入1mL的甲醇，用超純水定容至刻度，在紫外可見分光度計上掃描，繪制吸收曲線（圖3.1.2），從

49、圖3.1.2中可以看出在此方法下乙酰丙酸的最大吸收波長為210nm，但是在由于在210nm處水和甲醇的溶劑效應(yīng)，所以選擇266nm。</p><p>　　圖3.1.2 吸收曲線</p><p>　　3.1.3色譜柱的選擇</p><p>　　高效液相色譜分析的關(guān)鍵問題是分離和檢測。通過3.1.1,3.1.2的研究，檢測的問題已經(jīng)解決，現(xiàn)在開始討論分離的問題。能否有效

50、分離取決于色譜柱及色譜操作條件的選擇，也就是色譜分離的熱力學(xué)條件及動力學(xué)條件的探討。</p><p>　　由于流動相攜帶樣品流經(jīng)色譜柱的分離是依據(jù)樣品在流動相和色譜柱當中的溶解、吸附、滲透或離子交換等的作用不同，樣品在兩相間進行連續(xù)多次地分配過程，使得分配系數(shù)K不同的各組分，經(jīng)過一定長度的色譜柱后，由于在固定中的移動速度不同，彼此分離開來，先后流出色譜柱。而分配系數(shù)K是指在一定的溫度和壓力下，當組分在流動相和固定

51、相的分配達到平衡時，組分在固定相中的濃度與流動相中的濃度之比值。其值越大，表示其在固定相中的濃度越大，在色譜柱中的移動速度就越慢。</p><p>　　色譜柱的種類可大致分為五類，它們分別是以C18為代表的高效反相液相色譜柱、正相高效液相色譜柱、高效親水液相色譜柱、高效強陽離子交換液相色譜柱和Innovation TM高效多功能液相色譜柱。</p><p>　　而反相高效液相色譜是指固定相

52、采用強疏水性的填料，流動相采用有機溶劑的對樣品進行分離的方法。此方法應(yīng)用范圍極廣，通用性強。而C18色譜柱使用的填料就是強疏水性的，可以以極性較強的水、甲醇、乙腈作為流動相，來分離樣品。本文采用C18色譜柱作為分析乙酰丙酸的色譜柱，得到了較好的分離。</p><p>　　3.1.4流動相體系的選擇</p><p>　　液相色譜中流動相對物質(zhì)的分離影響大，因此選擇合適的流動相對實驗的結(jié)果有積

53、極的影響。反相色譜的流動相以強極性的水為主，加入甲醇、乙腈等其他極性有機溶劑來改變流動相的極性，以此來達到分離樣品中各組分的效果。 </p><p>　　乙酰丙酸屬于低級有機酸，由于羰基的作用使其具有更強的極性和酸性。就因為這樣，對液相色譜分離條件的要求就高了許多。有機酸的液相色譜測定方法中常采用的流動相為磷酸鹽水溶液[32]，但由于無機鹽結(jié)晶的存在，不利于泵的保養(yǎng)并影響色譜柱的壽命。在實驗中發(fā)現(xiàn)在乙腈-水和甲醇

54、-水體系下，乙酰丙酸的峰型相差不是很大，但是考慮到乙腈的毒性比甲醇的要強，因此選擇了甲醇-水體系。</p><p>　　圖3.1.4.1 在乙腈：水=10:90條件下乙酰丙酸峰圖</p><p>　　圖3.1.4.2 在甲醇：水=10:90條件下乙酰丙酸峰圖</p><p>　　3.1.5流動相配比的選擇</p><p>　　液相色譜的流

55、動相不僅承擔(dān)了攜帶被分離樣品的作用，還有選擇性地分離樣品中各組分的作用。因此，改變流動相的組成，配制不同極性的流動相，可以對復(fù)雜的樣品成分進行有效的分離。</p><p>　　采用甲醇-水作為流動相體系，分別考察甲醇和水的比例為10:90，13:87和15：85的流動相配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的增加，乙酰丙酸保留時間縮短，而甲醇比例過小，峰型不好，由圖3.1.5.1、圖3.1.5.2和圖3.1.5.3可知在甲醇

56、-水(85:15)時乙酰丙酸出峰時間適宜，而且峰型較好，無需用緩沖溶液。</p><p>　　圖3.1.5.1 在甲醇：水=10:90的配比下，乙酰丙酸峰圖</p><p>　　圖3.1.5.2 在甲醇：水=13:87的配比下，乙酰丙酸峰圖</p><p>　　圖3.1.5.3 在甲醇：水=15:85的配比下，乙酰丙酸峰圖</p><p>　

57、　3.1.6 流動相流速的選擇</p><p>　　流速雖然對分離效果的影響不是很大，但流速的改變會引起所有譜峰的保留時間的改變，所以實驗過程中要保證一定的流速。流速慢會使得所有峰的保留時間變長，如果流速過慢則會影響分析的速度；流速快會導(dǎo)致保留時間變短，但是流速過快則會導(dǎo)致要分離的樣品并沒有達到最佳的分離效果就已經(jīng)進入檢測器，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此要適當控制流速。實驗考察了0.6mL·min-1，0.7

58、 mL·min-1，0.8mL·min-1的標樣分析。由圖3.1.6.1、圖3.1.6.2和圖3.1.6.3可知，0.6mL·min-1的流速時，峰型較好，保留時間最適宜，所以選用0.6mL·min-1為本次實驗的流速。</p><p>　　圖3.1.6.1 在0.6mL·min-1下，乙酰丙酸峰圖（t=4.68min）</p><p>　

59、　圖3.1.6.2 在0.7mL·min-1下，乙酰丙酸峰圖（t=4.018min）</p><p>　　圖3.1.6.3在0.8mL·min-1下，乙酰丙酸峰圖（t=3.515min）</p><p>　　3.1.7柱溫的選擇</p><p>　　柱溫對樣品的分離效果有影響，過高或過低都不利于分析。溫度過低可能會導(dǎo)致幾種物質(zhì)的峰分不開，會互相干

60、擾。適當?shù)厣咧鶞赜欣谔岣咧?，縮短分析時間。實驗考察了25℃、30℃下進行標樣分析。由圖3.1.7.1和圖3.1.7.2可知，25℃的出峰時間適宜，峰型較好，所以選用的柱溫為25℃。</p><p>　　圖3.1.7.1在25℃下，乙酰丙酸峰圖（t=4.57min）</p><p>　　圖3.1.7.2在30℃下，乙酰丙酸峰圖（t=3.888min）</p><p

61、>　　3.1.8色譜分離條件的最終確定</p><p><b>　　具體色譜條件如下</b></p><p>　　色譜柱：Lichrspher-Cl8(4.6 mm ×150 mm，5μm )</p><p>　　流動相：甲醇:水=15:85</p><p>　　流速：0.6ml·min-1&l

62、t;/p><p><b>　　柱溫：25℃</b></p><p>　　檢測波長：266nm </p><p><b>　　進樣量：5μL</b></p><p>　　3.2標準曲線及線性范圍的測定</p><p>　　在最佳色譜條件下，取5支1mL的容量瓶，分別加入乙酰丙酸標準

63、溶液，調(diào)節(jié)乙酰丙酸的濃度分別為5.00mg·mL-1、10.00mg·mL-1、15.00mg·mL-1、20.00mg·mL-1、25.00mg·mL-1。在最佳實驗波長266nm下測定其對應(yīng)的吸光度。圖3.2.1為對應(yīng)的標準曲線圖，其標準方程為Y=24.357X+70.46962，r=0.9992，線性范圍為5.00-25.00mg·mL-1，線性關(guān)系良好。</p&g

64、t;<p>　　圖3.2.1 乙酰丙酸的標準曲線</p><p><b>　　3.3精密度的測定</b></p><p>　　選擇乙酰丙酸的濃度為50.0mg·mL-1，在最佳條件下，平行測定6組，結(jié)果見表3.3 ，根據(jù)表中數(shù)據(jù)可以看出該方法的精密度R.S.D為1.6%，符合分析要求。</p><p>　　表3.3乙酰丙

65、酸標準溶液平行測定結(jié)果</p><p>　　R.S.D的計算公式：</p><p>　　Xi—標準曲線上對應(yīng)物質(zhì)的濃度；</p><p><b>　　X—平均濃度.</b></p><p><b>　　3.4穩(wěn)定性試驗</b></p><p>　　精密吸取同一標準品溶液各5μ

66、L。分別在0，2，4，6，8h測定，記錄乙酰丙酸的峰面積值，由表3.4.1可知峰面積的RSD為2.3%(n=5)，表明乙酰丙酸溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。</p><p>　　表3.4.1乙酰丙酸穩(wěn)定性數(shù)據(jù)</p><p>　　此外，用紫外分光光度計研究了標準品的穩(wěn)定保存時間，稱取一定的乙酰丙酸標準溶液至于100mL的容量瓶中，加入1.0ml的甲醇，用超純水定容至刻度，用紫外分光光度計在210nm-

67、280nm的波長下測定其吸光度，檢測其穩(wěn)定性，數(shù)據(jù)見附表3.4.2，由此可知乙酰丙酸的水溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。</p><p>　　圖3.4標準品的穩(wěn)定保存時間</p><p><b>　　3.5重復(fù)性試驗</b></p><p>　　取乙酰丙酸標準品5份，精密稱定，在上述色譜條件下進樣5μL測定，測定乙酰丙酸峰面積值，由表3.5可知乙酰丙酸峰面

68、積的RSD為2.3%(n=5)。</p><p>　　表3.5 乙酰丙酸重復(fù)性數(shù)據(jù)</p><p>　　3.6樣品含量及回收率試驗</p><p>　　3.6.1釀造醬油樣品含量及回收率試驗</p><p>　　1.取5.0mL的樣品溶液于25mL的容量瓶中，分別加2.0mL的22%乙酸鋅溶液和10.6%亞鐵氰化鉀溶液，用超純水定容至刻度，混

69、合均勻后，離心，過濾，取經(jīng)0.45μm濾膜過濾后的濾液進樣分析。</p><p>　　本實驗采用標準加入法，分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL儲備溶液于2mL的容量瓶中，再加入0.5mL樣品，用超純水定容。在最佳色譜條件下測定，數(shù)據(jù)見附表3.6.1，譜圖見附圖。</p><p>　　圖3.6.1.1釀造醬油樣品的測定</p><p>　　由上述

70、標準曲線可知，Y=39.42+73.85X，根據(jù)標準加入法，可知CX=0.5338mg·mL-1,因此釀造醬油中的乙酰丙酸濃度為2.7 mg·mL-1。</p><p>　　2.精密吸取乙酰丙酸的儲備溶液各0.2mL、0.4mL，0.6mL于2mL的容量瓶中，加入已知濃度的樣品溶液0.5mL，用超純水定容，在上述色譜條件下進樣5μL，測定乙酰丙酸峰面積值，計算回收率（見表3.6.1.2）。結(jié)果

71、表明，方法的回收率在91.2-103.6%之間，符合分析要求。</p><p>　　表3.6.1.2乙酰丙酸的加標回收試驗</p><p>　　3.6.2配制醬油樣品含量及回收率試驗</p><p>　　1.取5.0mL的樣品溶液于25mL的容量瓶中，分別加2.0mL的22%乙酸鋅溶液和10.6%亞鐵氰化鉀溶液，用超純水定容至刻度，混合均勻后，離心，過濾，取經(jīng)0.4

72、5μm濾膜過濾后的濾液進樣分析。</p><p>　　本實驗采用標準加入法，分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL儲備溶液于2 mL的容量瓶中，再加入0.5mL樣品，用超純水定容。在最佳色譜條件下測定，數(shù)據(jù)見附表3.6.2，譜圖見附圖。</p><p>　　圖3.6.2.1配制醬油樣品的測定</p><p>　　由上述標準曲線可知，Y=43.58+

73、71.94X，根據(jù)標準加入法，可知CX=0.6058 mg·mL-1，因此配制醬油中的乙酰丙酸濃度為3.0 mg·mL-1。</p><p>　　2.精密吸取乙酰丙酸的儲備溶液各0.2mL、0.4mL，0.6mL于2mL的容量瓶中，加入已知濃度的樣品溶液0.5mL，用超純水定容，在上述色譜條件下進樣5μL，測定乙酰丙酸峰面積值，計算回收率（見表3.6.2.2）。結(jié)果表明，方法的回收率在94.6

74、-103.5%之間，符合分析要求。</p><p>　　表3.6.2.2乙酰丙酸的加標回收實驗</p><p><b>　　3.7新穎之處</b></p><p>　　1.2007版SB分析醬油中的乙酰丙酸的方法是氣相色譜法，使用的色譜柱為石英彈性毛細管柱或J&W DB-FFAP色譜柱，樣品經(jīng)有機溶劑萃取三次，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉進行吸水

75、處理后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用乙酸乙酯溶解殘留物并定容至5mL,進樣檢測。此法樣品前處理方法復(fù)雜，儀器操作繁瑣，而且，由于醬油中乙酰丙酸含量極微，在此操作條件下，乙酰丙酸會有損耗，對結(jié)果產(chǎn)生影響。而采用高效液相色譜法，前處理方法簡單，易操作，結(jié)果準確。</p><p>　　2.賀才珍[6]等、江勇[8]等和段文仲[29]等和所采取高效液相色譜法分析了醬油中乙酰丙酸的含量，本研究與上述三種方法的研究，比較見表。&l

76、t;/p><p><b>　　表3.7 方法比較</b></p><p>　　綜上所述，本實驗方法在樣品前處理處選擇了蛋白質(zhì)沉淀法，避免了一些物質(zhì)的干擾，而色譜條件是根據(jù)實驗室具體操作條件所定下來的，在此條件下，醬油樣品中乙酰丙酸出峰時間適宜，峰形較好，結(jié)果準確。</p><p><b>　　4 結(jié) 論</b></p&g

77、t;<p>　　本文采用高效液相色譜法并選擇了紫外檢測器，確定了如下醬油中乙酰丙酸的最佳檢測條件：</p><p>　　色譜柱：Lichrspher-Cl8(4.6 mm ×150 mm，5μm )</p><p>　　流動相：甲醇-水=15:85</p><p>　　流速：0.6ml·min-1</p><p&

78、gt;<b>　　柱溫：25℃</b></p><p>　　檢測波長：266nm</p><p><b>　　進樣量：5μL</b></p><p>　　在上述的最佳色譜條件下，對方法的精密度和回收率進行了測定，最終實現(xiàn)了準確測定醬油中乙酰丙酸的含量，原理簡單，方法可行，分析速度有一定程度的提高，條件易于掌控。如果有時間，

79、本研究最好能再進行如下研究：</p><p>　　1．本文是按照江勇[8]文獻中的方法來處理樣品的，未這個條件進行研究，如果有時間，應(yīng)該對樣品處理時目標物乙酰丙酸是否有損失等問題進行研究。</p><p>　　2.色譜干擾實驗還有待完善。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Cha J

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94、gt;　　附表3.2乙酰丙酸的標準曲線測定結(jié)果</p><p>　　附表3.3乙酰丙酸標準溶液平行測定結(jié)果</p><p>　　附表3.4.1乙酰丙酸穩(wěn)定性數(shù)據(jù)</p><p>　　附表3.4.2標準品的穩(wěn)定保存時間</p><p>　　表3.5 乙酰丙酸重復(fù)性數(shù)據(jù)</p><p>　　附表3.6.1.1釀造醬油樣品的

95、測定</p><p><b>　　譜圖如下：</b></p><p>　　附表3.6.1.2釀造醬油中乙酰丙酸的加標回收試驗</p><p>　　附表3.6.2.1配制醬油樣品的測定</p><p><b>　　譜圖如下：</b></p><p>　　附表3.6.2.2配制醬