月月粉丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及分析.pdf

1、丁香酚(Eugenol)是月月粉(Rosa chinensis‘Pallida’)重要的花香成分之一，具有濃郁的丁香氣味。前人研究表明，丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferyl acetate)為底物，由丁香酚合成酶催化形成的?？寺》治鲈录径∠惴雍铣擅富颍粌H有利于明確丁香酚合成酶基因在花香調(diào)控中的作用，而且為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有香味的月季品種提供候選基因。
　　 本文以古老月季品種月月粉為材料，利用RT-PCR結(jié)合RACE

2、-PCR技術(shù)，克隆了月月粉RcEGS1基因，并運(yùn)用實時熒光定量PCR法進(jìn)行了該基因在不同組織部位和不同開放時期花瓣中的表達(dá)分析。將RcEGS1基因的完整編碼框通過酶切、連接轉(zhuǎn)到植物表達(dá)載體pBIA31中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBIA31-RcEGS1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法成功轉(zhuǎn)化矮牽牛。本研究結(jié)果為進(jìn)一步對RcEGS1進(jìn)行功能驗證和深入探討月季苯基丙烯類物質(zhì)代謝路徑奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　 1.利用GenBank發(fā)表的

3、丁香酚合成酶基因的氨基酸保守序列設(shè)計引物，用同源克隆法和RACE-PCR技術(shù)，從中國古老月季月月粉盛開期的花瓣中獲得了一個新的月季丁香酚合成酶基因，命名為RcEGS1，GenBank登錄號為JQ522949。該基因全長為1171bp，開放閱讀框(ORF)951bp，編碼317個氨基酸，具有EGS基因的保守結(jié)構(gòu)域KQVDVVIS和KIIAAIK；其蛋白質(zhì)理論分子量為35.64kD，等電點為7.36。氨基酸同源序列比較發(fā)現(xiàn)，月季RcEGS1

4、與矮牽牛PhIGS1的氨基酸保守區(qū)同源性最高，具有70％同源性，與羅勒ObEGS1同源性達(dá)59％，與月季RhEGS1的同源性為48％。
　　 2.運(yùn)用實時熒光定量PCR法對月月粉6個不同發(fā)育時期的花朵和4個不同組織部位進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RcEGS1基因在花瓣、萼片中有表達(dá)，在葉片、莖段中沒有表達(dá)，以花瓣中的表達(dá)量為最高，且在花蕾期沒有表達(dá)，在盛開期的表達(dá)量最高，凋謝期表達(dá)量較低。即該基因的表達(dá)和月季花香物質(zhì)釋放量呈現(xiàn)一致的規(guī)律。

5、r>　　 3.用SmaI、SalI雙酶切質(zhì)粒pMD18-RcEGS1和表達(dá)載體pBIA31，將回收的全長基因片段和pBIA31大片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，對重組子菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，電泳獲得預(yù)期約1000bp的條帶，說明已成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBIA31-RcEGS1。
　　 4.將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，采用葉盤法轉(zhuǎn)化無菌矮牽牛的幼嫩葉片。經(jīng)過共