豬瘟細胞苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及ELISA法在抗原定量測定中的應(yīng)用.pdf

1、以豬瘟病毒中國兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)為實驗材料，首先采用常規(guī)細胞實時計數(shù)的方法，得到正常犢牛睪丸細胞增殖曲線和帶毒睪丸細胞的增殖曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒不僅不影響犢牛睪丸細胞的生長，反而促進細胞的分裂增殖，培養(yǎng)48小時時，帶毒的牛睪丸細胞計數(shù)是未帶毒細胞的117.5％。初步確立了該毒株在原代犢牛睪丸細胞中增殖的規(guī)律與基本特性。再進一步運用直接免疫熒光法確定出最佳細胞初始密度、最佳接毒量及接毒方式的產(chǎn)毒模型，建立了常規(guī)的病毒增殖曲

2、線。
　　 以建立的細胞及病毒生長曲線及產(chǎn)毒模型為依據(jù)，根據(jù)GMP生產(chǎn)車間的實際情況，從生產(chǎn)種毒繁殖、原代細胞制備、CSFV的感染、CSFV感染后維持液的調(diào)節(jié)以及帶CSFV的犢牛睪丸細胞的多次傳代這幾個對CSFV增殖有影響的因素方面入手進一步展開工作。
　　 嚴格控制生產(chǎn)種毒，優(yōu)質(zhì)達標的生產(chǎn)種毒，是疫苗病毒含量達標的必要保障。
　　 原代細胞制備過程中，依據(jù)《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（以下簡稱：《規(guī)程》）

3、無菌摘取犢牛睪丸，在《規(guī)程》的指導(dǎo)基礎(chǔ)上，調(diào)整消化時間、溫度可以同時達到提高細胞數(shù)量及質(zhì)量的雙重效果。將《規(guī)程》消化時間調(diào)整為0.25％的胰酶37℃ 消化30 min后降低溫度繼續(xù)消化。結(jié)果，每1g睪丸組織可制備3×105個/ml細胞懸液400-500ml，是傳統(tǒng)消化法的兩倍，并且細胞活力明顯增強，消化后期降低溫度可減輕后期胰酶的作用強度，減少對已消化好細胞的傷害。
　　 脾組織毒對次代牛睪丸細胞有很強的刺激作用，生產(chǎn)接毒時適度

4、減少組織毒，同時補入一定量病毒含量≥106細胞毒液，可減少組織毒對細胞的刺激作用，降低細胞的脫瓶率，提高病毒液的收次。
　　 在病毒液收獲期間，增大維持液量，將《規(guī)程》中10％的維持液調(diào)節(jié)為20％,4天收獲一次延長為8天收獲一次，經(jīng)兔體檢驗，病毒含量仍能達到5×104ml。
　　 病毒含量測定方面，應(yīng)用豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒（IDEXXHerdCheck Co.）對經(jīng)兔體檢驗已知滴度的20份HCLV半成品細胞病毒